Hva er Polyakrylamid Gel Elektroforese (SIDE)?

Elektroforetiske teknikker separat ladede molekyler i et elektrisk felt. Mobilitet av et molekyl er omvendt proporsjonal med størrelsen og direkte proporsjonal til sin kostnad. I løpet av elektroforese, proteiner bevege seg mot en motsatt ladet elektrode i et elektrisk felt.,

pris på deres bevegelse i en elektroforetiske systemet er styrt av flere faktorer slik som temperatur, pH, og buffer konsentrasjon i tillegg til iboende egenskaper som størrelse, kostnad og form av proteiner.

Elektroforetiske separasjon av proteiner strengt på grunnlag av deres molekylære vekten er bare mulig hvis belastningen av alle protein molekyler som kan bli manipulert til det samme tegn. I et slikt tilfelle, mobilitet av protein molekyler vil utelukkende være avhengig av deres størrelse.,

Polyakrylamid gel elektroforese (SIDE) er en teknikk basert på denne ideen, og er brukt for å skille proteiner på grunnlag av deres størrelse.

Prinsippene om SIDE

I SIDE, en anioniske vaskemiddel kalt sodium dodecyl sulfat (SDS) er brukt til å binde seg til proteiner og gi dem en negativ ladning. Proteiner er deretter skilt electrophoretically i henhold til deres størrelse ved hjelp av en gel matrise laget av polyakrylamid i et elektrisk felt.

Polyakrylamid er produsert som et resultat av polymerisering reaksjon mellom akrylamid og N,N’-methylene-bis-akrylamid (BIS) ved hjelp av en katalysator., Graden av polymerisering eller cross-linking kan kontrolleres ved å justere konsentrasjon av akrylamid og BIS.

mer cross-linking hardere gel. Hardheten i gelen, i sin tur, modulerer den friksjon som oppleves av makromolekyler når de reiser gjennom gelen under SIDEN, og dermed påvirke oppløsning av separasjon.

Løs gur (4-8% akrylamid) tillater høyere molekylvekt molekyler til å migrere raskere gjennom gelen, mens hard gele (12-20% akrylamid) begrense overføring av store molekyler og selektivt tillate små til å flytte gjennom gelen.,

SDS-PAGE-protokollen

1. Klargjøring:

Protein prøvene er denaturert ved å varme dem med et vaskemiddel SDS og mercaptoethanol. Den tidligere binder seg sterkt til proteiner og gir dem en høy negativ ladning, mens sistnevnte frigjør sulfhydryl grupper, og dermed gir polypeptid kjeder bokførte et overskudd negativ ladning og lignende kostnader til masse-forhold. Dette bidrar til løsning av proteiner strengt basert på deres størrelse i løpet av gel elektroforese.

2., Gel forberedelse:

Den elektroforetiske gel vanligvis har flere komponenter, inkludert akrylamid, BIS, og en buffer. Blandingen er degassed å unngå bobledannelse under polymerisering av gel. Ammonium persulfate, en fri radikal kilde, og en stabilizer er lagt til start polymerisering. BIS er også lagt til form kryssbindinger mellom akrylamid molekyler til en gel er til syvende og sist dannet.

3. Elektroforese:

Som en elektrisk strøm brukes proteiner vandrer gjennom gelen til den positive elektroden som de har en negativ ladning., Hvert molekyl beveger seg på en annen kurs basert på den molekylære vekten – små molekyler beveger seg raskere gjennom gelen enn større. Migrasjon er vanligvis raskere med høyere spenning. Etter et par timer, protein molekyler er alle skilt etter størrelse.

4. Farging og visualisering:

Når elektroforese er fullført, gel kan være farget ved hjelp av fargede fargestoffer som Coomassie Brilliant Blue eller etidiumbromid å gjøre den utskilte proteiner vises like tydelig farget bånd på gelen.

Ubundne fargestoff er vasket ut fra gelen., Farget gele blir deretter tørket slik at fargen intensiteten av protein band kan måles. Band av radioaktive proteiner kan bli oppdaget av autoradiography. Proteiner kan også kvantifiseres som protein innhold er direkte proporsjonal med mengden av bundet fargestoff.

Noen gel systemer innføre en sporing fargestoff som bromophenol blå sammen med protein eksempel – synlig avstand reiste med fargen på gel hjelper i å bestemme den nødvendige varigheten av elektroforese., Bromophenol blå reiser sammen med prøven molekyler før det til slutt kommer til bunnen av gel. Elektroforese er behov for å stoppe på dette punktet for å sikre at ingen protein molekyler electrophorese ut av gel og inn i bufferen.

Mer å Lese

• Alle Elektroforese Innhold
• Elektroforese som et Verktøy i Etterforskning
• Typer av Kapillær Elektroforese

Referanser