Vad är Polyakrylamidgelelektrofores (sida)?

elektroforetiska tekniker separerar laddade molekyler i ett elektriskt fält. Mobiliteten hos en molekyl är omvänt proportionell mot dess storlek och direkt proportionell mot dess laddning. Under elektrofores rör sig proteiner mot en motsatt laddad elektrod i ett elektriskt fält.,

hastigheten för deras rörelse i ett elektroforetiskt system styrs av flera faktorer såsom temperatur, pH och buffertkoncentration utöver inneboende egenskaper såsom storlek, laddning och form av proteinerna.

elektroforetisk separation av proteiner strikt på grundval av deras molekylvikt är endast möjlig om laddningen av alla proteinmolekyler kan manipuleras till samma tecken. I ett sådant fall kommer rörligheten hos proteinmolekylerna endast att vara beroende av deras storlek.,

Polyakrylamidgelelektrofores (sida) är en teknik baserad på denna idé och används för att separera proteiner på grundval av deras storlek.

principer för sidan

på sidan används ett anjoniskt rengöringsmedel som kallas natriumdodecylsulfat (SDS) för att binda till proteiner och ge dem en negativ laddning. Proteiner separeras sedan elektroforetiskt enligt deras storlek med hjälp av en gelmatris gjord av polyakrylamid i ett elektriskt fält.

polyakrylamid framställs som ett resultat av polymerisationsreaktionen mellan akrylamid och N,n’-metylen-bis-akrylamid (BIS) med hjälp av en katalysator., Graden av polymerisation eller tvärbindning kan styras genom att justera koncentrationen av akrylamid och BIS.

ju mer tvärbindningen desto hårdare gelén. Gelens hårdhet modulerar i sin tur friktionen som upplevs av makromolekyler när de reser genom gelén under sidan, vilket påverkar separationsupplösningen.

lösa geler (4-8% akrylamid) tillåter molekyler med högre molekylvikt att migrera snabbare genom gelén medan hårda geler (12-20% akrylamid) begränsar migreringen av stora molekyler och selektivt tillåter små att röra sig genom gelén.,

SDS-PAGE protokoll

1. Provberedning:

proteinprover denatureras genom uppvärmning av dem med ett tvättmedel SDS och merkaptoetanol. Den förra binder starkt till proteinerna och ger dem en hög negativ laddning medan den senare frigör sulfhydrylgrupper, vilket ger polypeptidkedjor som bär en överdriven negativ laddning och liknande laddning till massförhållande. Detta hjälper upplösningen av proteiner strikt baserat på deras storlek under gelelektrofores.

2., Gelpreparat:

den elektroforetiska gelén har vanligtvis flera komponenter, inklusive akrylamid, BIS och en buffert. Blandningen avgasas för att förhindra bubbelbildning under polymerisering av gelén. Ammoniumpersulfat, en fri radikal källa och en stabilisator tillsätts för att starta polymerisation. BIS tillsätts också för att bilda tvärlänkar mellan akrylamidmolekyler tills en gel slutligen bildas.

3. Elektrofores:

som en elektrisk ström appliceras proteiner migrera genom gelén till den positiva elektroden eftersom de har en negativ laddning., Varje molekyl rör sig i en annan takt baserat på dess molekylvikt – små molekyler rör sig snabbare genom gelén än större. Migration är vanligtvis snabbare vid högre spänningar. Efter några timmar separeras proteinmolekylerna alla efter storlek.

4. Färgning och visualisering:

När elektrofores är klar kan gelén färgas med färgade färgämnen som Coomassie Brilliant Blue eller ethidium bromid för att få de separerade proteinerna att visas som distinkta färgade band på gelén.

obundet färgämne tvättas ut från gelén., De färgade gelerna torkas sedan så att färgintensiteten hos proteinbanden kan mätas. Band av radioaktiva proteiner kan detekteras genom autoradiografi. Proteinerna kan också kvantifieras eftersom proteinhalten är direkt proportionell mot mängden av det bundna färgämnet.

vissa gelsystem introducerar ett spårningsfärgämne som bromofenolblå tillsammans med proteinprovet – det synliga avståndet som färgas av färgämnet på gelén hjälper till att bestämma den önskade varaktigheten av elektrofores., Bromofenolblå färdas tillsammans med provmolekylerna tills den så småningom når botten av gelén. Elektrofores måste stanna vid denna punkt för att säkerställa att inga proteinmolekyler elektrofores ut ur gelén och in i bufferten.

Vidare läsning

• All elektrofores innehåll
• elektrofores som ett verktyg i rättsmedicin
• typer av kapillär elektrofores

citat