Co to jest elektroforeza żelowa Poliakrylamidowa (PAGE)?

techniki elektroforetyczne oddzielają naładowane cząsteczki w polu elektrycznym. Ruchliwość cząsteczki jest odwrotnie proporcjonalna do jej wielkości i wprost proporcjonalna do jej ładunku. Podczas elektroforezy białka poruszają się w kierunku przeciwstawnie naładowanej elektrody w polu elektrycznym.,

szybkość ich ruchu w układzie elektroforetycznym jest regulowana przez kilka czynników, takich jak temperatura, pH i stężenie bufora, oprócz wewnętrznych właściwości, takich jak rozmiar, ładunek i kształt białek.

elektroforetyczna separacja białek ściśle na podstawie ich masy cząsteczkowej jest możliwa tylko wtedy, gdy ładunek wszystkich cząsteczek białka może być manipulowany do tego samego znaku. W takim przypadku mobilność cząsteczek białka będzie zależała wyłącznie od ich wielkości.,

elektroforeza żelowa Poliakrylamidowa (PAGE) jest techniką opartą na tym pomyśle i służy do oddzielania białek na podstawie ich wielkości.

Zasady strony

W stronie stosuje się anionowy detergent zwany siarczanem dodecylu sodu (SDS), który wiąże się z białkami i nadaje im ładunek ujemny. Białka są następnie oddzielane elektroforetycznie w zależności od ich wielkości za pomocą matrycy żelowej wykonanej z poliakrylamidu w polu elektrycznym.

poliakryloamid powstaje w wyniku reakcji polimeryzacji między akryloamidem A N,N'-metyleno-bis-akryloamidem (BIS) przy użyciu katalizatora., Stopień polimeryzacji lub usieciowania można kontrolować poprzez regulację stężenia akrylamidu i BIS.

im bardziej usieciowane, tym twardszy żel. Twardość żelu z kolei moduluje tarcie doświadczane przez makrocząsteczki podczas podróży przez żel podczas strony, wpływając w ten sposób na rozdzielczość separacji.

żele sypkie (4-8% akrylamidu) umożliwiają szybszą migrację cząsteczek o większej masie cząsteczkowej przez żel, natomiast żele twarde (12-20% akrylamidu) ograniczają migrację dużych cząsteczek i selektywnie pozwalają małym cząsteczkom przemieszczać się przez żel.,

protokół SDS-PAGE

1. Przygotowanie próbki:

próbki białka są denaturowane przez ogrzewanie ich detergentem SDS i merkaptoetanolem. Pierwszy wiąże się silnie z białkami i daje im wysoki ładunek ujemny, podczas gdy drugi uwalnia grupy sulfhydrylowe, dając w ten sposób łańcuchy polipeptydowe niosące nadmiar ładunku ujemnego i podobny ładunek do stosunku masy. Pomaga to w rozdzielczości białek ściśle w oparciu o ich rozmiar podczas elektroforezy żelu.

2., Przygotowanie żelu:

żel elektroforetyczny zwykle zawiera kilka składników, w tym akryloamid, BIS i bufor. Mieszanina jest odgazowywana, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków podczas polimeryzacji żelu. Nadsiarczan amonu, źródło wolnych rodników i stabilizator są dodawane do rozpoczęcia polimeryzacji. BIS dodaje się również w celu utworzenia połączeń krzyżowych między cząsteczkami akrylamidu, aż ostatecznie powstanie żel.

3. Elektroforeza:

w miarę stosowania prądu elektrycznego białka migrują przez żel do elektrody dodatniej, ponieważ mają ładunek ujemny., Każda cząsteczka porusza się w innym tempie w zależności od jej masy cząsteczkowej – małe cząsteczki poruszają się szybciej przez żel niż większe. Migracja jest zwykle szybsza przy wyższych napięciach. Po kilku godzinach cząsteczki białka są oddzielone wielkością.

4. Barwienie i wizualizacja:

Po zakończeniu elektroforezy żel może być barwiony za pomocą barwników, takich jak Błękit brylantowy Coomassie lub bromek etydyny, aby oddzielone białka pojawiły się jako odrębne kolorowe pasma na żelu.

niezwiązany barwnik jest wypłukiwany z żelu., Barwione żele są następnie suszone, aby można było zmierzyć intensywność koloru pasm białkowych. Pasma radioaktywnych białek można wykryć za pomocą autoradiografii. Białka można również określić ilościowo, ponieważ zawartość białka jest wprost proporcjonalna do ilości związanego barwnika.

niektóre systemy żelowe wprowadzają barwnik śledzący, taki jak błękit bromofenolowy wraz z próbką białka – widoczna odległość przebyta przez barwnik na żelu pomaga w określeniu wymaganego czasu trwania elektroforezy., Błękit bromofenolowy przemieszcza się wraz z cząsteczkami próbki, aż ostatecznie dotrze do dna żelu. Elektroforeza musi się zatrzymać w tym momencie, aby zapewnić brak elektroforezy cząsteczek białka z żelu i do bufora.

Czytaj dalej

• Cała zawartość elektroforezy
• elektroforeza jako narzędzie w kryminalistyce
• rodzaje elektroforezy kapilarnej

Cytaty