Mi a poliakrilamid gél elektroforézis (oldal)?

elektroforetikus technikák külön töltött molekulák egy elektromos mezőben. A molekula mobilitása fordítottan arányos a méretével, és közvetlenül arányos a töltésével. Az elektroforézis során a fehérjék egy ellentétes töltésű elektróda felé mozognak egy elektromos mezőben.,

az elektroforetikus rendszerben történő mozgásuk sebességét számos tényező szabályozza, mint például a hőmérséklet, a pH és a pufferkoncentráció a belső tulajdonságok mellett, mint például a fehérjék mérete, töltése és alakja.

a fehérjék elektroforetikus szétválasztása szigorúan molekulatömegük alapján csak akkor lehetséges, ha az összes fehérje molekula töltése ugyanarra a jelre manipulálható. Ebben az esetben a fehérjemolekulák mobilitása kizárólag a méretüktől függ.,

a poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE) egy ezen az elképzelésen alapuló technika, amelyet a fehérjék méretük alapján történő elválasztására használnak.

page

a PAGE-ben egy nátrium-dodecil-szulfát (SDS) nevű anionos mosószert használnak a fehérjékhez való kötődéshez, és negatív töltést adnak nekik. A fehérjéket ezután méretük szerint elektroforetikusan elválasztják egy poliakrilamidból készült gélmátrix segítségével egy elektromos mezőben.

a poliakrilamidot az akrilamid és az N,N’-metilén-bisz-akrilamid (bisz) közötti polimerizációs reakció eredményeként állítják elő katalizátor alkalmazásával., A polimerizáció vagy a keresztkötés mértéke az akrilamid és a BISZ koncentrációjának beállításával szabályozható.

minél nagyobb a keresztkötés, annál nehezebb a gél. A gél keménysége viszont modulálja a makromolekulák által tapasztalt súrlódást, amikor a gélen keresztül haladnak az oldal során, ezáltal befolyásolja az elválasztás felbontását.

Laza gélek (4-8% akrilamid) lehetővé teszik a nagyobb molekulasúlyú molekulák vándorolnak gyorsabban át a gél, míg a kemény gélek (12-20% akrilamid) korlátozza a migráció nagy molekulák, valamint a szelektíven engedi kicsik, hogy mozoghat a gél.,

SDS-Page protocol

1. Mintaelőkészítés:

A Fehérjemintákat denaturáljuk úgy, hogy detergens SDS-vel és merkaptoetanollal melegítjük őket. Az előbbi erősen kötődik a fehérjékhez, és magas negatív töltést ad nekik, míg az utóbbi felszabadítja a szulfhidrilcsoportokat, így a polipeptidláncok túlzott negatív töltést és hasonló töltést eredményeznek a tömegarányhoz képest. Ez segíti a fehérjék felbontását szigorúan a méretük alapján a gél elektroforézis során.

2., Gélkészítmény:

az elektroforetikus gélnek általában több összetevője van, beleértve az akrilamidot, a BISZ-t és a puffert. A keveréket gáztalanítják, hogy megakadályozzák a buborékképződést a gél polimerizációja során. A polimerizáció megkezdéséhez ammónium-perszulfátot, egy szabad gyök forrását és egy stabilizátort adunk hozzá. A BIS-t az akrilamid molekulák közötti keresztkapcsolatok kialakításához is hozzáadják, amíg végül gél képződik.

3. Elektroforézis:

mivel elektromos áramot alkalmaznak, a fehérjék a gélen keresztül a pozitív elektródra vándorolnak, mivel negatív töltésük van., Minden molekula molekulatömege alapján eltérő sebességgel mozog – a kis molekulák gyorsabban mozognak a gélen, mint a nagyobbak. A migráció általában magasabb feszültségeknél gyorsabb. Néhány óra múlva a fehérjemolekulákat méret szerint választják el.

4. Festés és vizualizáció:

az elektroforézis befejezése után a gélt színes festékekkel, például Coomassie briliáns kék vagy etidium-bromiddal lehet megfesteni, hogy az elválasztott fehérjék különálló színes sávokként jelenjenek meg a gélen.

a nem kötött festéket a gélből kimossák., A festett géleket ezután szárítjuk, így a fehérjeszalagok színintenzitása mérhető. A radioaktív fehérjék sávjait autoradiográfiával lehet kimutatni. A fehérjék számszerűsíthetők is, mivel a fehérjetartalom közvetlenül arányos a kötött festék mennyiségével.

egyes gélrendszerek nyomkövető festéket, például bromofenol kéket vezetnek be a fehérjemintával együtt – a festék által a gélen megtett látható távolság segít az elektroforézis szükséges időtartamának meghatározásában., A bromofenol kék a mintamolekulákkal együtt halad, amíg végül el nem éri a gél alját. Az elektroforézist ezen a ponton le kell állítani, hogy a gélből és a pufferbe ne kerüljön fehérjemolekulák elektroforezise.

további olvasás

• minden elektroforézis tartalom
• elektroforézis mint eszköz a kriminalisztika
• típusú kapilláris elektroforézis

hivatkozások