Qu’est-ce que L’électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (PAGE)?

Les techniques électrophorétiques séparent les molécules chargées dans un champ électrique. La mobilité d’une molécule est inversement proportionnelle à sa taille et directement proportionnelle à sa charge. Pendant l’électrophorèse, les protéines se déplacent vers une électrode chargée de manière opposée dans un champ électrique.,

la vitesse de leur mouvement dans un système électrophorétique est régie par plusieurs facteurs tels que la température, le pH et la concentration du tampon en plus de propriétés intrinsèques telles que la taille, la charge et la forme des protéines.

la séparation électrophorétique des protéines strictement sur la base de leur poids moléculaire n’est possible que si la charge de toutes les molécules de protéines peut être manipulée au même signe. Dans un tel cas, la mobilité des molécules protéiques dépendra uniquement de leur taille.,

L’électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (PAGE) est une technique basée sur cette idée et est utilisée pour séparer les protéines en fonction de leur taille.

principes de la PAGE

dans la PAGE, un détergent anionique appelé dodécylsulfate de sodium (SDS) est utilisé pour se lier aux protéines et leur donner une charge négative. Les protéines sont ensuite séparées électrophorétiquement en fonction de leur taille à l’aide d’une matrice de gel en polyacrylamide dans un champ électrique.

Le Polyacrylamide est produit à la suite de la réaction de polymérisation entre l’acrylamide et le N,N’-méthylène-bis-acrylamide (BIS) à l’aide d’un catalyseur., Le degré de polymérisation ou de réticulation peut être contrôlé en ajustant la concentration d’acrylamide et de BIS.

plus la réticulation est importante, plus le gel est dur. La dureté du gel, à son tour, module le frottement subi par les macromolécules lorsqu’elles traversent le gel pendant la PAGE, affectant ainsi la résolution de la séparation.

Les gels lâches (4-8% d’acrylamide) permettent aux molécules de poids moléculaire plus élevé de migrer plus rapidement à travers le gel tandis que les gels durs (12-20% d’acrylamide) limitent la migration des grosses molécules et permettent sélectivement aux petites de se déplacer à travers le gel.,

protocole SDS-PAGE

1. Préparation des échantillons:

Les échantillons de protéines sont dénaturés en les chauffant avec un détergent SDS et du mercaptoéthanol. Le premier se lie fortement aux protéines et leur donne une charge négative élevée tandis que le second libère les groupes sulfhydryle, donnant ainsi des chaînes polypeptidiques portant une charge négative en excès et un rapport charge / masse similaire. Cela aide à la résolution des protéines strictement en fonction de leur taille lors de l’électrophorèse sur gel.

2., Préparation de Gel:

le gel électrophorétique a habituellement plusieurs composants comprenant l’acrylamide, le BIS, et un tampon. Le mélange est dégazé pour éviter la formation de bulles lors de la polymérisation du gel. Du persulfate d’Ammonium, une source de radicaux libres et un stabilisant sont ajoutés pour commencer la polymérisation. Le BIS est également ajouté pour former des liaisons croisées entre les molécules d’acrylamide jusqu’à ce qu’un gel soit finalement formé.

3. Électrophorèse:

Lorsqu’un courant électrique est appliqué, les protéines migrent à travers le gel vers l’électrode positive car elles ont une charge négative., Chaque molécule se déplace à une vitesse différente en fonction de son poids moléculaire – les petites molécules se déplacent plus rapidement à travers le gel que les plus grandes. La Migration est généralement plus rapide à des tensions plus élevées. Après quelques heures, les molécules de protéines sont séparées par la taille.

4. Coloration et visualisation:

Une fois l’électrophorèse terminée, le gel peut être coloré à l’aide de colorants colorés tels que le bleu brillant de Coomassie ou le bromure d’éthidium pour faire apparaître les protéines séparées sous forme de bandes colorées distinctes sur le gel.

le colorant non lié est éliminé du gel., Les gels colorés sont ensuite séchés afin que l’intensité de la couleur des bandes de protéines puisse être mesurée. Des bandes de protéines radioactives peuvent être détectées par autoradiographie. Les protéines peuvent également être quantifiées car la teneur en protéines est directement proportionnelle à la quantité de colorant lié.

certains systèmes de gel introduisent un colorant de suivi tel que le bleu de bromophénol avec l’échantillon de protéine – la distance visible parcourue par le colorant sur le gel aide à décider de la durée requise de l’électrophorèse., Le bleu de bromophénol voyage avec les molécules d’échantillon jusqu’à ce qu’il atteigne finalement le fond du gel. L’électrophorèse doit s’arrêter à ce stade pour s’assurer qu’aucune molécule de protéine ne s’électrophore hors du gel et dans le tampon.

Lecture

• Tous les Électrophorèse Contenu
• l’Électrophorèse comme un Outil d’Investigation
• Types d’Électrophorèse Capillaire

les Citations