¿Qué es la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)?

Electroforética de las técnicas de separar moléculas cargadas en un campo eléctrico. La movilidad de una molécula es inversamente proporcional a su tamaño y directamente proporcional a su carga. Durante la electroforesis, las proteínas se mueven hacia un electrodo con carga opuesta en un campo eléctrico.,

la velocidad de su movimiento en un sistema electroforético se rige por varios factores como la temperatura, el pH y la concentración de tampón, además de propiedades intrínsecas como el tamaño, la carga y la forma de las proteínas.

la separación electroforética de proteínas estrictamente sobre la base de su peso molecular es posible solo si la carga de todas las moléculas de proteína se puede manipular al mismo signo. En tal caso, la movilidad de las moléculas proteicas dependerá únicamente de su tamaño.,

la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es una técnica basada en esta idea y se utiliza para separar proteínas en función de su tamaño.

principios de PAGE

en PAGE, un detergente aniónico llamado dodecil sulfato de sodio (SDS) se utiliza para unirse a las proteínas y darles una carga negativa. Las proteínas se separan electroforéticamente de acuerdo con su tamaño utilizando una matriz de gel hecha de poliacrilamida en un campo eléctrico.

La poliacrilamida se produce como resultado de la reacción de polimerización entre acrilamida y N,n’-metileno-bis-acrilamida (BIS) utilizando un catalizador., El grado de polimerización o reticulación se puede controlar ajustando la concentración de acrilamida y BIS.

cuanto más se entrecruzan, más duro es el gel. La dureza del gel, a su vez, modula la fricción experimentada por las macromoléculas cuando viajan a través del gel durante la página, afectando así la resolución de la separación.

Los geles sueltos (4-8% de acrilamida) permiten que las moléculas de mayor peso molecular migren más rápido a través del gel, mientras que los geles duros (12-20% de acrilamida) restringen la migración de moléculas grandes y permiten selectivamente que las pequeñas se muevan a través del gel.,

protocolo SDS-PAGE

1. Preparación de la muestra:

Las muestras de proteína se desnaturalizan calentándolas con un detergente SDS y mercaptoetanol. El primero se une fuertemente a las proteínas y les da una alta carga negativa, mientras que el segundo libera grupos sulfhidrilo, produciendo así cadenas de polipéptidos que llevan un exceso de carga negativa y una relación de carga a masa similar. Esto ayuda a la resolución de las proteínas estrictamente en función de su tamaño durante la electroforesis en gel.

2., Preparación del Gel:

el gel electroforético generalmente tiene varios componentes, incluyendo acrilamida, BIS y un tampón. La mezcla se desgasifica para evitar la formación de burbujas durante la polimerización del gel. El persulfato de amonio, una fuente de radicales libres, y un estabilizador se añaden para iniciar la polimerización. BIS también se agrega para formar enlaces cruzados entre moléculas de acrilamida hasta que finalmente se forma un gel.

3. Electroforesis:

a medida que se aplica una corriente eléctrica, las proteínas migran a través del gel al electrodo positivo, ya que tienen una carga negativa., Cada molécula se mueve a una velocidad diferente en función de su peso molecular: las moléculas pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel que las más grandes. La migración suele ser más rápida a voltajes más altos. Después de unas horas, las moléculas de proteína se separan por tamaño.

4. Tinción y visualización:

una vez finalizada la electroforesis, el gel se puede teñir utilizando tintes de colores como el azul brillante de Coomassie o el bromuro de etidio para que las proteínas separadas aparezcan como bandas de colores distintas en el gel.

el tinte sin unir se elimina del gel., Los geles teñidos luego se secan para que se pueda medir la intensidad del color de las bandas de proteínas. Bandas de proteínas radiactivas pueden ser detectadas por autorradiografía. Las proteínas también se pueden cuantificar ya que el contenido de proteínas es directamente proporcional a la cantidad del tinte Unido.

algunos sistemas de gel introducen un tinte de seguimiento como el azul de bromofenol junto con la muestra de proteína: la distancia visible recorrida por el tinte en el gel ayuda a decidir la duración requerida de la electroforesis., El azul de bromofenol viaja junto con las moléculas de la muestra hasta que finalmente llega al fondo del gel. La electroforesis debe detenerse en este punto para garantizar que no se electroforicen moléculas de proteínas fuera del gel y dentro del tampón.

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