Was ist Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)?

Elektrophoretische Techniken trennen geladene Moleküle in einem elektrischen Feld. Die Beweglichkeit eines Moleküls ist umgekehrt proportional zu seiner Größe und direkt proportional zu seiner Ladung. Während der Elektrophorese bewegen sich Proteine in einem elektrischen Feld zu einer entgegengesetzt geladenen Elektrode.,

Die Geschwindigkeit ihrer Bewegung in einem elektrophoretischen System wird zusätzlich zu den intrinsischen Eigenschaften wie Größe, Ladung und Form der Proteine von mehreren Faktoren wie Temperatur, pH-Wert und Pufferkonzentration bestimmt.

Die elektrophoretische Trennung von Proteinen streng nach ihrem Molekulargewicht ist nur möglich, wenn die Ladung aller Proteinmoleküle auf das gleiche Vorzeichen manipuliert werden kann. In einem solchen Fall hängt die Beweglichkeit der Proteinmoleküle ausschließlich von ihrer Größe ab.,

Die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) ist eine Technik, die auf dieser Idee basiert und zur Trennung von Proteinen auf der Grundlage ihrer Größe verwendet wird.

Prinzipien von PAGE

In PAGE wird ein anionisches Reinigungsmittel namens Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet, um an Proteine zu binden und ihnen eine negative Ladung zu geben. Proteine werden dann elektrophoretisch entsprechend ihrer Größe unter Verwendung einer Gelmatrix aus Polyacrylamid in einem elektrischen Feld getrennt.

Polyacrylamid wird als Ergebnis der Polymerisationsreaktion zwischen Acrylamid und N,N‘-Methylen-bis-Acrylamid (BIS) unter Verwendung eines Katalysators hergestellt., Der Polymerisations-oder Vernetzungsgrad kann durch Einstellen der Konzentration von Acrylamid und BIS gesteuert werden.

Je mehr die Vernetzung desto härter das Gel. Die Härte des Gels moduliert wiederum die Reibung, die Makromoleküle beim Durchlaufen des Gels während der Reinigung erfahren, wodurch die Auflösung der Trennung beeinflusst wird.

Lose Gele (4-8% Acrylamid) ermöglichen eine schnellere Migration von Molekülen mit höherem Molekulargewicht durch das Gel, während harte Gele (12-20% Acrylamid) die Migration großer Moleküle einschränken und selektiv zulassen, dass sich kleine durch das Gel bewegen.,

SDS-PAGE-Protokoll

1. Probenvorbereitung:

Proteinproben werden durch Erhitzen mit einem Reinigungsmittel SDS und Mercaptoethanol denaturiert. Ersteres bindet stark an die Proteine und gibt ihnen eine hohe negative Ladung, während letzteres Sulfhydrylgruppen freisetzt, wodurch Polypeptidketten mit einer übermäßigen negativen Ladung und einem ähnlichen Ladungs-Masse-Verhältnis entstehen. Dies hilft bei der Auflösung von Proteinen streng nach ihrer Größe während der Gelelektrophorese.

2., Gelzubereitung:

Das elektrophoretische Gel enthält normalerweise mehrere Komponenten, einschließlich Acrylamid, BIS und einen Puffer. Die Mischung wird entgast, um Blasenbildung während der Polymerisation des Gels zu verhindern. Ammoniumpersulfat, eine Quelle freier Radikale und ein Stabilisator werden hinzugefügt, um die Polymerisation zu beginnen. BIS wird auch hinzugefügt, um Querverbindungen zwischen Acrylamidmolekülen zu bilden, bis letztendlich ein Gel gebildet wird.

3. Elektrophorese:

Wenn ein elektrischer Strom angelegt wird, wandern Proteine durch das Gel zur positiven Elektrode, da sie eine negative Ladung haben., Jedes Molekül bewegt sich mit einer anderen Geschwindigkeit, basierend auf seinem Molekulargewicht – kleine Moleküle bewegen sich schneller durch das Gel als größere. Die Migration ist normalerweise bei höheren Spannungen schneller. Nach einigen Stunden sind die Proteinmoleküle alle nach Größe getrennt.

4. Färbung und Visualisierung:

Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, kann das Gel mit farbigen Farbstoffen wie Coomassie Brilliant Blue oder Ethidiumbromid gefärbt werden, damit die getrennten Proteine als deutliche farbige Bänder auf dem Gel erscheinen.

Ungebundener Farbstoff wird aus dem Gel ausgewaschen., Die gefärbten Gele werden dann getrocknet, so dass die Farbintensität der Proteinbänder gemessen werden kann. Bänder radioaktiver Proteine können durch Autoradiographie nachgewiesen werden. Die Proteine können auch quantifiziert werden, da der Proteingehalt direkt proportional zur Menge des gebundenen Farbstoffs ist.

Einige Gelsysteme führen zusammen mit der Proteinprobe einen Tracking-Farbstoff wie Bromophenolblau ein – der sichtbare Abstand, den der Farbstoff auf dem Gel zurücklegt, hilft bei der Entscheidung der erforderlichen Elektrophoresedauer., Bromophenolblau bewegt sich zusammen mit den Probenmolekülen, bis es schließlich den Boden des Gels erreicht. Die Elektrophorese muss an dieser Stelle aufhören, um sicherzustellen, dass keine Proteinmoleküle aus dem Gel und in den Puffer Elektrophorese.

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