En Identifikation av Element i E. coli
ÄR element var först upptäcktes av de effekter som uppstår om dessa element är integrerade i lac (Malamy, 1966, 1970) och gal operons (Saedler och Starlinger, 1967a,b; Jordan et al., 1967; Adhya och Shapiro, 1969) av E. coli och i början av åt höger operon av sin bacteriophage lambda (Brachet et al., 1970)., Elementen orsakar en null mutation av genen i vilken de integrerar och en mycket stark polär effekt på alla gener av operonen som ligger distalt till den muterade genen. Mutationerna återgår spontant till den vilda typen, men frekvensen av återgång kunde inte förstärkas av mutagener. Detta väckte misstanken om att mutationerna inte var punktmutationer, men DNA-omarrangemang.,
det kunde visas att mutationen tillsatte DNA till gal-operonen genom att jämföra densiteten hos givande lambda dgal bakteriofag som gjorde eller inte Bar mutationen och var på annat sätt isogen (Jordan et al., 1968; Shapiro, 1969). Detta utesluter möjligheten att mutationerna orsakades av en inversion av DNA. För att skilja mellan de två återstående möjligheterna, dubbelarbete av en del av gal-operonen eller införande i denna operon av orelaterat DNA, Michaelis et al., (1969) jämförde det muterade och icke-muterade DNA: t genom att hybridisera RNA transkriberat från mutanten till antingen DNA. Dessa experiment visade tydligt att det extra DNA som hittades i mutanterna inte härleddes från gal-operonen. Dessutom kunde det visas att det extra DNA i två oberoende mutanter delade åtminstone några av dessa sekvenser. Detta ökade möjligheten att mutanterna inte orsakades av införandet av slumpmässiga segment av E. coli-DNA, utan snarare av införlivandet av specifika överförbara element.,
denna hypotes visade sig vara sann, när ett större antal mutanter undersöktes genom att införa HETERODUPLEX DNA-molekyler i elektronmikroskopet (Fiandt et al., 1972; Hirsch et al., 1972a,b, Malamy et al., 1972). Vid den tidpunkten kunde fyra olika element identifieras. De kallades infogningssekvenser (IS) och numrerade i följd IS1 genom IS4. IS1 är ungefär 0,8 Kb (kilobaser) lång. Den andra är element har en längd på cirka 1,5 Kb. En femte elementet, IS5, av liknande storlek (Blattner et al.,, 1974) och ett större element på lite mer än 5 Kb, som av historiska skäl kallas γ-δ(Guyer, 1978), har detekterats sedan, men antalet verkar vara nära mättnad för E. coli K12.
inom begränsningen av elektronmikroskopet delar de olika IS-elementen inte sekvenser, medan olika isolat av samma element är identiska. Naturligtvis utesluter detta inte små sekvensskillnader mellan de senare.,
hybridisering av lämpliga DNA – enskilda strängar som endast delar IS-elementet i komplementär form, följt av matsmältning med singelsträngsspecifika nukleaser tillåter isolering av is-DNA i ren form (Ohtsubo och Ohtsubo, 1976; Schmidt et al., 1976). Den snabba utvecklingen av DNA-begränsningsanalyser och sekvenseringsmetoder har faktiskt tillåtit bestämning av den fullständiga sekvensen av IS1 (Ohtsubo och Ohtsubo, 1978; Johnsrud, 1979) och IS2 (Ghosal et al., 1979a). Sekvensen av IS4 är nära färdigställd vid skrivandet av detta kapitel (R. Klaer et al. opublicerade experiment).,
DNA–DNA-hybridiseringstekniker har använts för att söka efter förekomsten av IS-element i E. coli-kromosomen. IS1 och IS2 är närvarande i 8 respektive 5 exemplar (saedler och Heiss, 1973). Användningen av Southern blotting teknik möjliggjorde exakt bestämning av kopian antal IS3 i E. coli K12, och av IS4 . Dessutom visades några av IS-elementen att bäras på E. coli fertility plasmid F (Davison et al., 1975a), och på vissa R faktorer (Hu et al., 1975).,
IS-elementen är inte kända för att koda gener som översätts till proteiner, men i fallet med IS1 utesluter den kända DNA-sekvensen inte möjligheten att översättningen till en (få) peptid (er) av begränsad storlek. Längden på IS-elementen utesluter bildandet av stora proteiner. De kända effekterna av IS-element är därför begränsade till positionen, där de är integrerade, och till intilliggande DNA-sekvenser i position cis. Dessa effekter beskrivs i följande avsnitt.
en annan klass av transposerbara DNA-element har beskrivits sedan 1974., De kallas transposoner. Som regel är de större än vad som är element och detekteras av effekter som orsakas av protein kodat i transposon-DNA. De första transposonerna beskrev koda resistens mot antibiotika, och de flesta transposoner kända bär resistensgener (Datta et al., 1971, Säkring och Jacob, 1974; för recensioner, se Cohen, 1976; Kleckner, 1977). Det finns dock transposoner som kodar för en E. coli-enterotoxin (så et al., 1979), eller gener för laktos jäsning (Cornells et al., 1979)., Tn3, förutom att bära en gen för β-laktamas, bär också gener som är involverade i införlivandeprocessen (Heffron et al., 1977; Gill et al. 1978, Chou m.fl., 1979). Detsamma verkar vara sant för Tn5 (Berg et al., 1978).
transposoner finns i naturen som delar av plasmider. Införlivandet mellan plasmider förklarar variationen i fråga om flera läkemedelsresistens hos olika plasmider. I laboratoriet har införlivande med genomet av bakteriofag upptäckts såväl som införlivande med bakteriekromosomen., Ingen av de kända transposonerna är emellertid en naturlig beståndsdel i E. coli K12-kromosomen.
litteraturen om transposoner expanderar snabbt, och för en beskrivning av de många olika transposoner som är kända vid skrivandet av denna artikel hänvisas läsaren till mer omfattande recensioner av detta ämne.
alla transposoner som hittills undersökts har en gemensam struktur: de har en upprepad DNA-sekvens vid sin termini och unika DNA-kodningsgener mellan dessa upprepade DNA-sekvenser. I de flesta fall inverteras de upprepade DNA-sekvenserna i förhållande till varandra., Deras storlek är variabel. I vissa transposoner är de inverterade upprepningarna ca 1,5 Kb, och det finns anledning att misstänka att dessa sekvenser är oberoende överförbara är element. I andra fall är det upprepade DNA endast ca 0,15 Kb (t. ex. Tn1-3, kodning av ampicillinresistens (Heffron et al. 1975; kopecko och Cohen, 1975).
I händelse av Tn9, som kodar för resistens mot kloramfenikol (McHattie och Jackowski, 1977), och Tn1681, kodning E. coli enterotoxin (Så et al., 1979), sekvensen upprepas vid termini IS1., I det senare fallet inverteras de två kopiorna av IS1 relativt varandra, medan de två IS1-kopiorna i det förra fallet är direkta upprepningar. Som det är känt från DNA-sekvensen av IS1 att detta element i sig avslutas med små missmatchade DNA-upprepningar, bevaras den allmänna regeln att själva Termini av transposoner är inverterade upprepningar även för Tn9. När det gäller IS2 (Ghosal et al., 1979a) och IS4 (Habermann m.fl., 1979), inverterade upprepningar finns på deras termini., Denna iakttagelse kan till och med innebära en roll för dessa inverterade upprepningar i införlivandeprocessen.