experimentell verifiering av modeller
den första metoden (3) identifierade de primära initieringsställena i 14 proteiner, inklusive bovin pankreas RNAs A och spermhval myoglobin, och även andra mindre stabila initieringsställen (11) i RNase A. Den primära initieringsstället för RNase a identifierades i denna modell som rester 106-118. Tillämpningen av det andra tillvägagångssättet (8) på RNase a (13) ledde till sex platser (visas i Fig., 3 A), som överensstämde med de som identifierats (11) genom den första metoden (3). Det här är rester 4-11 (Region a), rester 25-34 (Region B), rester 51-57 (Region C) och antiparallelstrukturer (inte nödvändigtvis pläterade ark) som bildas genom sammanslutning av rester 53-67 med rester 69-79 (Region D), rester 71-90 med rester 91-111 (Region E) och rester 103-111 med rester 115-124 (Region F). De efterföljande stegen längs vikningsvägen består av dessa regioners tillväxt eller koalescens. Region G bildas när rester 36-48 vik mot helix B., Region G innehåller dock kontakter med längre räckvidd än helix B. Därför anses G bildas i ett senare skede än B. Region L bildas av sammanslutning av region A med B, G och C. denna strukturella sekvens följs av Region H, bildad när regionerna C och D kommer i kontakt med region K som innehåller kontakter mellan regionerna E och F, av Region J där regionerna C och D bildar kontakter med regionerna E och F, och av region i som innehåller kontakter mellan regionerna E och H med G. slutligen bildas Region M när Region A kommer i kontakt med E och F.,
den förväntade primära vikningsinitieringsstället för RNase A är i överensstämmelse med den observerade svängningen vid rester 113 och 114 i den ursprungliga molekylen, med den mycket höga graden av bevarande av icke-polära rester i området 106-118 av 23 däggdjursarter av detta protein (3), och med experimentell information om intermediärer som detekterats i den termiska utfällningen av RNase a (14)., NMR bevis för lokal struktur i utfällda RNase A under vikningsförhållanden (15) och i fragment därav (16), och immunokemiska studier om bildandet av stabila antigena platser (på ytan av proteinet, som täcker begravda primära hydrofoba inledande plats när reducerad RNase a oxideras (ref. 17 och figur 8 ref. 18), överensstämde också med den här bilden. Andra experimentella bevis som stöder förekomsten av inledande platser A-F tillhandahålls i ref. 11.,
för apomyoglobin identifierade det första tillvägagångssättet (3) det primära infällningsstället som rester 103-115, som omfattar huvuddelen av G-helixen, med sekvensen Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-His-Val-Leu., Tillämpning av det andra tillvägagångssättet (8) och konformational-energiberäkningar ledde till förslaget att interaktioner mellan A, G och h-helices av apomyoglobin kan vara viktiga för vikningsinitiering (19), i överensstämmelse med experimentella resultat som involverade dessa regioner i jämviktsintermediärer av apomyoglobin (20) och i de tidigaste kinetiska stegen i vikningsvägen (21). Nyligen experimentella studier av myoglobin mutanter (22, 23) ger övertygande stöd för modeller som innehåller hydrofob initiering och förökning av vikning.,
Apomyoglobin har blivit ett paradigm för forskning om vikningsvägar (24). En del av apomyoglobinmolekylen, bestående av A -, G-och h-spiralerna och en del av B-helixen, viks snabbt för att bilda en mellanliggande påväg, med resten av polypeptidkedjan vikning i en långsammare takt, i storleksordningen sekunder (21, 25). Peptidfragment av apomyoglobin motsvarande g och h-helices visade en benägenhet för spiralstruktur (26-28), medan peptider som motsvarar resten av proteinet visade långt lägre benägenhet för helixbildning (29)., Men ett experiment där H-helixen av myoglobin muterades för att minska sin spiralformiga benägenhet (30) visade mycket lite inflytande på proteinens vikningshastighet. En mycket större effekt observerades när distal histidin (H64) ändrades till fenylalanin: substitutionen av en icke-polär sidokedja för den nedgrävda polar histidin resulterade i en signifikant ökning av vikningshastigheten (31). Dessa studier pekade mot vikten av sidokedjeförpackning, särskilt i kontaktytorna på helices, för graden av vikning av apomyoglobin.,
Apomyoglobin har fördelen att det kan studeras vid jämvikt under ett antal lösningsförhållanden som approximerar några av de observerbara stadierna på den kinetiska vikningsvägen. Således har det varit möjligt att definiera konformationspropensiteterna hos utfällda och delvis vikta apomyoglobin med NMR (32-35). Intressant, syra-utfällda apomyoglobin visar en benägenhet för icke-infödda spiralstruktur i en region som förbinder d och e helices, liksom den infödda-liknande struktur som observerats i A och H helices, som hade förutsetts i kinetiska studier (34)., NMR-studier av konformationspropensiteterna hos de olika formerna av apomyoglobin (32-35) inkluderade bestämning av relaxparametrarna för polypeptidkedjan till platsen-specifikt bestämma ryggraden dynamiken i var och en av proteinets tillstånd. I stället för den ”modellfria” analysen som är lämplig för vikta proteiner analyserades avslappningsdata genom att beräkna reducerade spektraldensitetsfunktioner j (0), J(wN) och J(wH) (36). Funktionen J (0) informerar på µs–ms tidsskala rörelser och föreslog att, för apomyoglobin vid pH 2.,3, A och G helices gjorde övergående kontakter (34). Detta spännande resultat, som senare validerats av spin-label NMR-studier (37), gav slutgiltiga bevis på native-liknande långdistanskontakter i ett utfällt protein. Ännu mer spännande visade funktionen J (wN), som informerar om ps–ns tidsskala rörelse, sekvensberoende variation, som kan korreleras med variation i en beräknad parameter, den ”genomsnittliga Arean begravd vid vikning” (AABUF) (10)., Denna parameter, som innehåller både reststorlek och hydrofobicitet, definieras för enskilda aminosyror, men är vanligtvis i genomsnitt över ett fönster med fem till nio rester i sekvensen och ger en alternativ kvantitativ uppskattning av hydrofobiciteten definierad av Matheson och Scheraga (3) när det gäller fri energi för bildning. I fallet med apomyoglobin vid pH 2,3, toppar i tomten av J (wN) vs., restnummer, som indikerar begränsning av sub-ns tidsskala rörelse, motsvarade extremt bra med toppar i AABUF-tomten, vilket indikerar ett högre än genomsnittligt antal stora och/eller icke-polära aminosyror. Denna observation föreslog att det finns ett mönster i aminosyrasekvensen, definierad av grupperingar av stora och/eller icke-polära sidokedjor, som i modellen av ref. 3, som leder till begränsning av rörelsen hos polypeptid ryggrad orsakad av lokal hydrofob klusterbildning.
Apomyoglobin vid pH 2.,3 behåller en liten benägenhet för spiralstruktur i A-och h-spiralen, som bedöms av de observerade NMR-kemiska skiftningarna (34). Dessa propensiteter avskaffas i närvaro av 8 m urea (35), men sekvensberoende av relaxationshastigheterna för urea-denaturerad apomyoglobin visar också en spännande korrelation med AABUF-parametern. I detta fall sambandet är mellan minima i J(wH) och maxima av AABUF, vilket tyder på att lokala hydrofoba interaktioner som begränsar ryggraden motion på sub-ns tidsskalor som är långlivade även i 8 M urea.,
för att testa hypotesen att AABUF-parametern, d.v. s. hydrofobicitet, kunde användas för att förutsäga vikningsinitieringsplatserna i polypeptidkedjan, gjordes en specifik uppsättning apomyoglobinmutationer (23). A-helixen, som deltar i den kinetiska mellanliggande som först bildas vid vikning av WT apomyoglobin, har en sekvens som ger upphov till ett maximum i AABUF-parametern, medan e-helixen, som i själva verket är mycket hydrofob enligt konventionella hydrofobicitetsskalor, har en ganska låg AABUF under hela sin längd., I vikta apomyoglobin ligger sidokedjan av Trp-14, i A-spiralen, mittemot ryggraden i e-spiralen vid Gly-73. En dubbel-mutant myoglobin framställdes, där Trp-14 ersattes med Gly, och Gly-73 ersattes med Trp. Det var motiverat att proteinets vikta struktur skulle störas minimalt av denna swap, men att AABUF-parametern för A-och e-spiralerna skulle påverkas drastiskt. Frågan var om Vikbanan också skulle påverkas. Faktum är att vikning av mutanten där G73 och W14 byts sker med en annan väg än WT-proteinet., Alla apomyoglobinvarianter som hittills har studerats vik via en burstfasmediär som innehåller spiralstruktur. När det gäller WT apomyoglobin innehåller denna mellanprodukt a, g och h-helices (och även en del av B-helixen). I G73-W14-växlingsmutanten innehåller intermediären e, g och h-spiralen; a-spiralen är inte skyddad i den inledande fasen av vikning, men viks senare. Detta resultat (visas i Fig. 4) bekräftades genom spin-label-studier som visade kontakter mellan e, g och H-helices i mutanten, snarare än A, G och H-kontakterna som observerades i WT-proteinet.,