detta material åtföljs av en presentation om proteinstruktur och principer bakom denatureringsprover och diskontinuerlig gelelektrofores.
separationen av makromolekyler i ett elektriskt fält kallas elektrofores. En mycket vanlig metod för att separera proteiner genom elektrofores använder en diskontinuerlig polyakrylamidgel som ett stödmedium och natriumdodecylsulfat (SDS) för att denaturera proteinerna. Metoden kallas natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-sida)., Det vanligaste systemet kallas också laemmli-metoden efter Storbritannien Laemmli, som var den första som publicerade ett papper med SDS-PAGE i en vetenskaplig studie.
SDS (även kallad laurylsulfat) är ett anioniskt tvättmedel, vilket innebär att dess molekyler när de löses har en negativ laddning inom ett brett pH-intervall. En polypeptidkedja binder mängder SDS i proportion till dess relativa molekylmassa. De negativa laddningarna på SDS förstör det mesta av den komplexa strukturen av proteiner och lockas starkt mot en anod (positivt laddad elektrod) i ett elektriskt fält.,
polyakrylamidgeler hindrar större molekyler från att migrera så fort som mindre molekyler. Eftersom förhållandet mellan laddning och massa är nästan detsamma bland SDS-denaturerade polypeptider, är den slutliga separationen av proteiner nästan helt beroende av skillnaderna i relativ molekylmassa av polypeptider. I en gel med likformig densitet är det relativa migreringsavståndet för ett protein (Rf, f som ett subscript) negativt proportionellt mot loggen av dess massa., Om proteiner av känd massa körs samtidigt med de okända, kan förhållandet mellan Rf och massa ritas och massorna av okända proteiner uppskattas.
proteinseparation med SDS-PAGE kan användas för att uppskatta relativ molekylmassa, för att bestämma den relativa överflöd av stora proteiner i ett prov och för att bestämma fördelningen av proteiner mellan fraktioner. Renheten hos proteinprover kan bedömas och utvecklingen av ett fraktionerings-eller reningsförfarande kan följas., Olika färgningsmetoder kan användas för att upptäcka sällsynta proteiner och att lära sig något om deras biokemiska egenskaper. Specialiserade tekniker som Western blotting, tvådimensionell elektrofores och peptidkartläggning kan användas för att upptäcka extremt knappa genprodukter, för att hitta likheter bland dem och för att detektera och separera isoenzymer av proteiner.
Molekylvikt mot molekylvikt
Molekylvikt (symbol m) uttrycks i Dalton (Da). En Dalton definieras som 1/12 massan av kol 12., De flesta makromolekyler är tillräckligt stora för att använda kiloDalton (kDa) för att beskriva molekylmassa. Molekylvikten är inte densamma som molekylmassan. Det är också känt som relativ molekylmassa (symbol Mr, där r är ett subscript). Molekylvikt definieras som förhållandet mellan massan av en makromolekyl till 1/12 massan av en kol 12 atom. Det är en dimensionslös mängd.
När litteraturen ger en massa i Da eller kDa avser den molekylmassa. Det är felaktigt att uttrycka molekylvikt (relativ molekylmassa) i Dalton., Ändå hittar du termen molekylvikt som används med Dalton eller kilodalton i viss litteratur, ofta med förkortningen MW för molekylvikt.
polyakrylamidgeler för SDS-PAGE
många system för proteinelektrofores har utvecklats, och apparater som används för SDS-PAGE varierar kraftigt. Den metod som används på dessa sidor använder laemmli-metoden. Hänvisning till laemmli metoden i ett material och metoder avsnitt eliminerar behovet av att beskriva buffertar, gjutning av geler, apparater, etc., Om inte papperet använder någon modifiering av metoden, är de enda detaljerna för SDS-sida som ska rapporteras i ett metodavsnitt procent Total akrylamid (%T) i en gel, relativ procentandel och typ av tvärbindare (%C), och kanske en hänvisning till geldimensionerna. Vi använder ett ”mini-gel” – system, med 3 1/4″ x 4″ gelkassetter.
SDS-PAGE kan utföras på förgjutna geler, vilket sparar problem och risk för att arbeta med akrylamid. Följande beskrivning gäller för butikstillverkade gjutnings-och körapparat som är mycket billigare än kommersiellt tillgänglig utrustning., Förutom kostnadseffektivitet är en fördel med att göra sina egna geler första gången en djupare förståelse av processen.
oavsett system kräver beredning gjutning av två olika lager akrylamid mellan glasplattor. Det undre skiktet (separera, eller lösa, gel) är ansvarig för att faktiskt separera polypeptider efter storlek. Det övre skiktet (staplingsgel) innefattar provbrunnarna. Den är utformad för att sopa upp proteiner i ett prov mellan två rörliga gränser så att de komprimeras (staplas) i mikrometer tunna skikt när de når separeringsgelén.,