gränser inom veterinärvetenskap

introduktion

ryggradslösa djur omfattar cirka en miljon djurarter som hålls både i zoologiska institutioner och i hushåll där de är hand upp som Exotiska husdjur (1). Snäckor omfattar nästan 60 000 arter av vatten-och landlevande blötdjur, främst sniglar och sniglar (1). Den gigantiska Afrikanska land snigel (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) är infödd till Östafrika, men det är en utbredd invasiv art i Asien, Oceanien, och mer nyligen i Amerika, där det har införts av misstag eller målmedvetet som en matkälla och som husdjur. Dess utsläpp i naturliga ekosystem, jordbruks-och stadsområden har resulterat i ekologiska, hälso-och jordbrukshot (2, 3). Den gigantiska Afrikanska land snigeln är en mellanvärd för flera parasiter inklusive Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp., och Fasciola hepatica (4, 5). Alla ovanstående helminter, med undantag för A. abstraus, kan orsaka allvarliga sjukdomar hos människor. Specifikt är den jätte afrikanska land snigeln den främsta gastropoden ansvarig för världsomspännande spridning av A. cantonensis som orsakar mänsklig eosinofil meningoencefalit i Asien och Amerika (2, 6). Riskfaktorer för infektion hos människor, husdjur och vilda djur med dessa helminthparasiter innefattar intag av råa eller underkokta infekterade sniglar eller sniglar eller livsmedel som är förorenade av slem av infekterade sniglar eller sniglar (4, 5, 7, 8).,

Även om de afrikanska jätte land sniglarna är bland de mest populära sniglarna som hålls som husdjur, och deras världsomspännande popularitet som Exotiska husdjur växer snabbt, har endast ett fåtal undersökningar genomförts om förekomsten av deras parasiter under naturliga förhållanden (2, 6, 9-11). Syftet med denna undersökning var att undersöka förekomsten av parasiter i jätte afrikanska land sniglar uppfödda som husdjur i södra Italien.,

material och metoder

allmänna Data

i augusti 2018 undersöktes tre pooler av färska fekala prover som erhållits från totalt 60 Jätte afrikanska land sniglar, som hölls i tre olika privata samlingar i Pozzuoli, Caserta och Neapel (Italien), för parasiter. Från varje ort fick vi en pool av avföring från 20 enskilda sniglar vardera. Sniglarna som ingick i denna undersökning hade en medianålder på 1,6 år från 0, 2 till 2 år och hade inte fått någon tidigare antiparasitisk behandling., Sniglar matades färska grönsaker och frukter; dessutom ett kalciumpulver tillskott (kalcium, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Tyskland) tillhandahölls två gånger i veckan. Alla djur uppföddes i Italien, privatägda och hölls som husdjur i fyra inomhusterrarier på 60 × 30 × 45 cm i storlek, i grupper om 10-20 djur (2 grupper av 20 sniglar i Pozzuoli och Caserta och 2 grupper av 10 sniglar vardera i Neapel)., En organisk torvjord (organisk Kokostorvjord, e-Coco-produkter, Gloucestershire, UK), tidigare värmebehandlad (100°C i 30 min) och sedan fri från parasiter och insekter, användes som substrat.

diagnostiska procedurer

tjugo gram färsk avföring erhölls ursprungligen från var och en av de fyra terrarierna., När poolade avföring analyseras genom färsk smeta, flotation och baermann test visade positivitet till rabditid nematoder, två sniglar från varje positivt terrarium inhystes individuellt i en steril plastlåda, och deras avföring samlades omedelbart efter avföring, i ett sterilt 50 ml plaströr. Coprologisk undersökning för poolade och enskilda prover inkluderade färskt smet, centrifugalflotation (2 g avföring för varje test) med användning av en lösning av socker och formaldehyd (specifik vikt 1.27) och Baermann test (10 g avföring för varje test)., Dessutom analyserades slem som erhölls under färsk smear-undersökning under ett ljusmikroskop. Eftersom larvformer av flera arter av maskar kan inkapslas i fotmuskeln av sniglar, histologisk undersökning av biopsiprover som skördats från de främre och bakre delarna av fotmuskeln utfördes i 30 sniglar, bedövas med den teknik som beskrivs av Giannelli et al. (12) och Gilbertson och Wyatt (13)., Biopsiproverna fixerades i 10% neutral fosfatbuffrad formalin och bearbetades genom rutinmetoder till paraffinblock som skars i 3 µm tjocka sektioner och färgades med hematoxylin och eosin. Studien utfördes under tillstånd av den praxis där den ägde rum och under undertecknad, skriftlig informerad ägare samtycke.

morfologisk identifiering

tillfälliga fästen gjordes genom värmedödande nematoder på glasskivor i en droppe vatten, varefter ett glas täckglas applicerades., Nematoder överfördes till en droppe kranvatten på en glasskiva och placerades på värmare (100°C) i 10 s. dessa prover användes för morfologisk identifiering. En AMPLIVAL ljusmikroskop, Carl Zeiss Jena, och en Leitz Diaplan med Nomarski optik användes för observation., Morfologisk identifiering av rhabditid nematoder följde Andrassy (14) och Andrassy (15) och det var mestadels baserat på morfologi svalg och stomi, och reproduktiva systemet, främst funktionerna i spicules, antal och position papiller eller närvaro och storlek eller form av bursa för män; och svans form, position vulva och morfologi av reproduktionssystemet för kvinnor. Identifieringen av larver baserades på svansformen.

molekylär analys

DNA extraherades från nematodprover erhållna från avföring fixerade i 96% etanol uppsamlad från de tre orterna., Nematoder tvättades i dubbeldestillerat vatten (ddH2O) över natten, före molekylär analys, för fullständigt avlägsnande av återstoder av etanol. Varje enskild nematod överfördes till ett sterilt Eppendorf-rör (200 µl) med 20 µl extraktionsbuffert (17,7 µl ddH2O, 2 µl 10 × koncentrerad PCR-buffert, 0,2 µl 1% Tween 20 och 0,1 µl proteinas K). Buffert och nematoder frystes vid -20 ° C i 20 minuter och inkuberades därefter omedelbart vid 65 ° C i 1 timme, följt av 10 minuter vid 95 ° C., Lysaterna kyldes på is och centrifugerades sedan (2 min, 9 000 g); 1 µl supernatant användes för PCR.

Ett fragment av rDNA som innehåller interna transkriberas spacer regioner (ITS1, 5.8 S, ITS2) förstärks med hjälp av primrar som är 18 ÅR: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (framåt), och 28S: 5′-TTT-CERT TCG CCG TTA CTA AGG-3′ (omvänd) (16). Ett fragment av rDNA som innehåller genen för 18S rRNA var förstärkt med hjälp av primrar 22F: 5′- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3′ (framåt), och 1080JR: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3′ (omvänd) (17). PCR-master mix bestod av: ddH2O, 7.,25µl; 10 × PCR-buffert, 1,25 µl; deoxinukleosidtrifosfater (dNTPs), 1 µl; 0,75 µl av både fram-och backprimer; polymeras, 0,1 µl; och 1 µl DNA-extrakt. PCR-profilerna användes enligt följande: för sin 1-cykel på 94 ° C i 7 min följt av 35 cykler på 94 ° C i 60 s, 50 ° C i 60 s och 72 ° C i 60 s och en slutlig förlängning vid 72 ° C i 7 min (14); för 18S 1-cykel på 94°C i 5 min, följt av 35 cykler på 94°C i 60 s, 55°C i 90 s och 72°C i 2 min och en slutlig förlängning vid 72°C i 10 min., PCR-produkterna sekvenserades av GATC Biotech (Tyskland) och senare redigerades och laddades upp till GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

resultat

Baermanntestet avslöjade närvaron av nematodlarver, vars längd varierade från 170 till 336 µm, i alla prover. Ägg, larver och vuxna rhabditid-nematoder detekterades genom färska smet-och flotationsmetoder i alla fekala prover. Rhabditella axei (Figur 1) identifierades morfologiskt från två av tre poolade och enskilda fekala prover från Pozzuoli och Neapel. Dessutom Rhabditis terricola, Cruznema sp., och Pristionchus entomophagus var isolerade från en pool och enskilda fekala prover från Caserta. Inga parasiter upptäcktes i muskelbiopsiproverna eller i slem.

flera morfologiska typer av rhabditid-nematoder isolerades från snigel avföring fixerad i 96% etanol. Erhållna och redigerade sekvenser av dess och 18S av dessa nematoder jämfördes (BLAST) med materialet i GenBank och identifierades som R. axei (delvis 18S, anslutningsnummer MK124578, likhet 99%), Rh., terricola (partiella 18S och partiella ITS1, anslutningsnummer MK156052, likhet 100%), P. Entomophagus (partiella 18S och partiella ITS1, anslutningsnummer MK156050, likhet 99%) och Cruznema sp. (partial 18S och partial ITS1, anslutningsnummer MK156051, likhet 96-100%).

diskussion

resultaten av denna studie visar att alla undersökta Jätte afrikanska land sniglar lägger ägg, larver och vuxna rhabditid nematoder i avföring och kan därför utgöra en infektionskälla för andra husdjur och människor. För att undvika misidentifiering med Strongyloides sp.,, en nematodart som visar nära likhet med rabditider som har en tydlig parasitisk zoonotisk relevans (14, 15, 18), bekräftades den initiala morfologiska diagnosen av rhabditid-nematoder genom molekylära analyser.

rhabditidae inkluderar fritt levande saprofytiska nematoder, som ofta finns i jord och organiskt skräp där de huvudsakligen matar på bakterier. Många arter av sniglar kan fungera som slutliga definitiva värdar för rhabditid nematoder (14, 15). Ett antal rhabditis-och rhabditella-arter har dock associerats med ryggradsdjur inklusive människor (14, 15, 19-27)., Även om deras närvaro kan vara resultatet av miljöförorening kan dessa nematoder orsaka sjukdomar hos många djur och människor. Rhabditis elongata, Rh. hominis och Rh. usuii larver har isolerats från mänskliga avföring, urin och vaginala swabs (19-21). Icke desto mindre har inte många fall av symtomatiska infektioner rapporterats hos människa (21-24). Feng och Li (25) beskrev två mänskliga fall av urininfektion av R. axei i Kina och Ahn et al. (20) rapporterade fem humana fall av tarminfektion med rhabditis sp. på landsbygden skolbarn i Sydkorea., På samma sätt beskrivs två fall av mänsklig tarminfektion av R. axei i Kina (26), medan ett annat publicerat arbete (21) rapporterade ett fall av tarminfektion hos ett 5 månader gammalt Brasilianskt barn som presenterades med feber och vattnig och blodig diarré.coprologisk undersökning avslöjade ägg, larver och vuxna av rhabdit sp. Meamar et al. (27) beskrev förekomsten av vattnig diarré hos två iranska patienter med AIDS, i samband med allvarlig tarminfektion av larver och vuxna exemplar av R. axei. Slutligen, Teschner et al., (24) nyligen beskrivit ett fall av yttre öronkanalinfektion hos en 37-årig man som presenterades med purulent otorrhea från båda öronen och akut hörselnedsättning orsakad av rhabditis sp. I allmänhet, Rhabditis spp. anses vara en vanlig orsak till extern otit hos nötkreatur som lever i tropiska områden (t.ex. Sydamerika och Afrika), särskilt hos äldre djur, och har identifierats även hos kycklingar, hundar och grisar med oöverkomlig diarré (18, 28-30). Emellertid har asymtomatiska infektioner också beskrivits och dessa nematoder anses ofta pseudoparasiter (28, 29).,

även om fritt levande nematoder hämtades i alla fekala prover hittades inga prover i slem och histologiska prover. En möjlig förklaring till detta är att nematoder kan lokalisera i olika vävnader/organ hos sina värdar, beroende på vilken typ av förening nematod / mollusk värd (15, 31, 32). Rhabditis spp. slutföra sin livscykel inne i snigeln, utan att skada dess molluscan värd. Tidigare studier om frigående afrikanska sniglar (Archachatina spp. och Achatina spp.) avslöjade att R., axei lever i mag-tarmkanalen i sin snigel värd där hela nematod livscykel är klar (31-33).

Även om Afrikansk jätte snigel står som värdar för R. axei, förekomsten av denna nematod hade rapporterats endast i ett fåtal arter av gigantiska Afrikanska sniglar andra än A. fulica, nämligen Archachatina marginata ovum, Ar. marginata saturalis, och Achatina achatina (31). Å andra sidan har P. Entomophagus en världsomspännande distribution och har huvudsakligen associerats med dungbaggar som tillhör superfamiljen Scarabaeoidea (34, 35), R., terricola har hittats i salamandrar (14, 15) och Cruznema spp. i cricket Gryllodes laplatae (Orthoptera) (36). I samtliga fall sker överföring av parasiten genom kontakt av sniglarna med förorenad fuktig jord som är rik på sönderdelning av organiskt material (31, 37). Även om alla djur i de nuvarande Fallen hölls i terraria med en värmebehandlad organisk jord spekulerar vi om att infektion kan ha inträffat innan djuren köptes i djuraffärer eller uppfödningsanläggningar.,

Sammanfattningsvis visar våra resultat att Pet giant African land sniglar kan fungera som reservoar av flera rhabditid nematoder. Denna snigelart är bland de vanligaste som hålls som husdjur, och bor därför ofta i närheten av människor. Som ett resultat är föroreningen av hemmiljön genom deras avföring möjlig. Även om parasitära nematoder inte isolerades i denna studie, bör de jätte afrikanska land sniglarna fortfarande betraktas som potentiella bärare av nematoder som kan orsaka opportunistiska sjukdomar hos människor., Därför betonar vi vikten av ytterligare epidemiologisk forskning om förekomsten av fritt levande och parasitiska nematoder i gastropod sniglar hålls i fångenskap, och betonar behovet av strikta kontrollåtgärder för att minska risken för opportunistisk infektion med rabditid nematoder hos sällskapsdjur snigelägare.

författare bidrag

Dd ’ O och MS tänkt och planerat analysen. MS och JN utförde analysen. CA hjälpte till att forma forskningen och redigerade manuskriptet. Alla författare gav kritisk feedback och bidrog till det slutliga manuskriptet.,

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

PubMed Abstract / Google Scholar