gelelektrofores Definition
gelelektrofores är ett förfarande som används för att separera biologiska molekyler efter storlek. Separationen av dessa molekyler uppnås genom att placera dem i en gel med små porer och skapa ett elektriskt fält över gelén. Molekylerna kommer att röra sig snabbare eller långsammare baserat på deras storlek och elektrisk laddning.,
Gelelektroforesöversikt
processen med gelelektrofores fungerar eftersom negativt laddade molekyler rör sig bort från den elektriska strömens negativa pol och mindre molekyler rör sig snabbare än större molekyler. Således uppnås en storleksseparation inom poolen av molekyler som löper genom gelén. Gelén fungerar på ett liknande sätt som en sil som separerar partiklar efter storlek. Elektrofores arbetar för att flytta partiklarna, med hjälp av deras inneboende elektriska laddning, genom sikten.,
När forskare försöker skilja mellan olika segment av DNA är processen till exempel enkel. Proverna laddas i kanaler i början av gelén. Varje DNA-molekyl har samma laddning (-1), eftersom DNA bildas av samma 4 nukleotider och alltid bär en något negativ laddning oavsett storlek. Därför kommer varje DNA-molekyl att ha samma kraft som drar den genom gelén.
storleken på varje molekyl hindrar emellertid dess framsteg genom gelén., Stora molekyler träffar delar av gelmatrisen och saktas ner. Små DNA-molekyler kan glida mellan de olika komponenterna i gelmatrisen och snabbt ta sig till den andra sidan av gelén. Efter en viss tid kan de färgade DNA-molekylerna ses aggregering i olika delar av gelén, baserat på hur långt de rörde sig under gelelektrofores. Detta gör det möjligt för forskare att identifiera segmenten och jämföra DNA från olika organismer.
vad används Gelelektroforer för?,
syftet med gelelektrofores är att visualisera, identifiera och skilja molekyler som har behandlats med en tidigare metod som PCR, enzymatisk matsmältning eller ett experimentellt tillstånd. Ofta går blandningar av nukleinsyror eller proteiner som samlas in från ett tidigare experiment/metod genom gelelektrofores för att bestämma identiteten eller differentiera mellan molekyler.,
Gelelektroforessteg
de breda steg som är involverade i ett gemensamt DNA-gel elektroforesprotokoll:
förbereda proverna för att köra
DNA: t isoleras och förbehandlas (t.ex. PCR, enzymatisk digestion) och består i lösning med något grundläggande blått färgämne för att visualisera provets rörelse genom gelén.
en agaros tae gel lösning framställs
tae buffert ger en källa till joner för att ställa in det elektriska fältet under elektrofores., Vikt-till-volymkoncentrationen av agaros i tae-buffert används för att bereda lösningen. Till exempel, om en 1% agarosgel krävs, tillsätts 1g agaros till 100 ml TAE. Den agarosprocent som används bestäms av hur stort eller litet DNA förväntas vara. Om man tittar på att separera en pool av mindre storlek DNA band (<500bp), en högre andel agarose gel (>1%) är beredd. Den högre andelen agaros skapar en tätare sikt för att öka separationen av små DNA-längdskillnader., Agaros-tae-lösningen upphettas för att lösa upp agarosen.
gjutning av gelén
agaros tae-lösningen hälls i en gjutbricka som, när gellösningen har svalnat och stelnat, skapar en gelplatta med en rad brunnar på toppen.
ställa in elektroforeskammaren
den fasta gelén placeras i en kammare fylld med tae-buffert. Gelén är placerad så att kammarbrunnarna ligger närmast kammarens negativa elektrod.,
laddar gelén
gelkammarbrunnarna laddas med DNA-proverna och vanligtvis laddas en DNA-stege också som referens för storlekar.
elektrofores
de negativa och positiva ledningarna är anslutna till kammaren och till en strömförsörjning där spänningen är inställd. Att slå på strömförsörjningen sätter upp det elektriska fältet och de negativt laddade DNA-proverna börjar migrera genom gelén och bort från den negativa elektroden mot det positiva.,
stoppar elektrofores och visualiserar DNA
När det blå färgämnet i DNA-proverna har migrerat genom gelén tillräckligt långt, stängs strömförsörjningen av och gelén avlägsnas och placeras i en etidiumbromidlösning. Ethidiumbromid intercalates mellan DNA och är synlig i UV-ljus. Ibland tillsätts ethidiumbromid direkt till agarosgellösningen i steg 2. Ethidium bromide stained gel utsätts sedan för UV-ljus och en bild tas. DNA-band visualiseras i från varje körfält som motsvarar en kammarbrunn., DNA-stegen som laddades visualiseras också och längden på DNA-banden kan uppskattas. Ett exempel ges i figuren nedan.
typer av gelelektrofores
det finns två typer av gelelektrofores: nativ och denaturing. Native gelelektrofores försöker vanligtvis att hålla RNA eller protein i sin ursprungliga struktur medan man kör den genom gelén., Denaturerande gelelektrofores försöker minska RNA eller proteinet i sin mest linjära struktur före eller under gelelektrofores.
denatureringen av RNA eller proteinet åstadkoms genom tillsats av ett reduktionsmedel till provet, gelen och / eller bufferten. Reduktionsmedlet separerar bindningar inom RNA eller proteinmolekylen och därigenom minskar dess sekundära struktur. Den sekundära strukturen hos ett protein eller RNA kommer att påverka, på ett icke-linjärt sätt, hur snabbt det migrerar genom en gel., En denaturerad, linjär form av RNA eller protein kommer emellertid att migrera proportionellt till dess linjära storlek (baspar eller kilo Dalton). Denaturerande gelelektrofores är ofta mer exakt för storlekidentifiering, medan nativ gelelektrofores vanligtvis används för att identifiera större proteinkomplex.
exempel på gelelektrofores
- Tae Agarose Gel elektrofores används oftast för DNA.
- TBE och DENATURERINGSSIDAN (polyakrylamidgelelektrofores) är vanliga för RNA-separation.,
- SDS PAGE är en denaturerande gelelektrofores som vanligen används för proteinidentifiering och separation.