Ett utkast till genom av Yersinia pestis från offer för den svarta döden | naturen

den svarta döden av 1347-1351, orsakad av bakterien Yersinia pestis2,3, ger ett av de bästa historiska exemplen på en framväxande infektion med snabb spridning och hög dödlighet och hävdar uppskattningsvis 30-50% av den europeiska befolkningen på bara en femårsperiod4. Skillnader i epidemiologiska trender mellan den medeltida sjukdomen och moderna Y. pestis infektioner har antänt kontroverser över pandemin aetiologic agent5, 6., Även om forntida DNA-undersökningar har starkt implicerat Y. pestis2, 3 i den gamla pandemin, kan genetiska förändringar i bakterien vara delvis ansvariga för skillnader i sjukdoms manifestation och svårighetsgrad. För att förstå organismens utveckling är det nödvändigt att karakterisera de genetiska förändringarna som är involverade i omvandlingen från en sylvatisk patogen till en som kan pandemisk mänsklig infektion på omfattningen av den svarta döden och för att bestämma dess förhållande till närvarande cirkulerande stammar., Här börjar vi denna diskussion genom att presentera det första utkastet till genomsekvens av den gamla patogenen.

Y. pestis är en nyligen utvecklad ättling av marklevande Bacillus Yersinia pseudotuberculosis7, som under sin utveckling förvärvade ytterligare två plasmider (pMT1 och pPCP1) som ger den specialiserade mekanismer för infiltrering av däggdjursvärdar. För att undersöka potentiella evolutionära förändringar i en av dessa plasmider rapporterade vi om screening av 46 tänder och 53 ben från East Smithfield-samlingen i London, England för närvaro av Y., pestisspecifik pPCP1 (ref. 3). Historiska data tyder på att Öster Smithfield begravningsplats etablerades i slutet av 1348 eller tidigt 1349 speciellt för dangerous av Svarta Döden victims8 (Kompletterande Figurerna 1 och 2), vilket gör den samling som är väl lämpad för genetiska undersökningar av gamla Y. pestis. DNA-sekvensdata för fem tänder erhållna via molekylär infångning av hela Y. pestis-specifik pPCP1 avslöjade ett C till T-skademönster som är karakteristiskt för autentisk endogen gammal DNA9, och montering av den poolade Illumina läser tillåtet återuppbyggnaden av 98.68% av 9.,6-kilobasplasmid minst dubbelt täckning3.

för att utvärdera lämpligheten av fångstbaserade metoder för att rekonstruera det fullständiga antika genomet användes flera DNA-extrakt från både rötter och kronor som härrör från fyra av de fem tänderna som gav den högsta pPCP1-täckningen3 för array-baserad anrikning (Agilent) och efterföljande höggenomströmning-sekvensering på Illumina GAII-plattformen10. Avlägsnande av dubbla molekyler och efterföljande filtrering producerade totalt 2,366,647 högkvalitativa kromosomala läsningar (kompletterande tabell 1a, b) med en genomsnittlig fragmentlängd på 55.,53 baspar (Kompletterande Fig. 4), vilket är typiskt för gammalt DNA. Täckning uppskattningar gav i genomsnitt 28,2 läser per plats för kromosomen, och 35,2 och 31,2 för pCD1 och pMT1 plasmider, respektive (Fig. 1a, C, D och Tilläggstabell 1b, c). Täckningen var förutsägbart låg för pPCP1 (Fig. 1e) eftersom sonder som är specifika för denna plasmid inte inkluderades på arrayerna. Täckning korrelerad med GC-innehåll (kompletterande Fig. 6), en trend som tidigare observerats för hög genomströmning sekvensdata11., Täckningen på varje halva av kromosomen var ojämn på grund av skillnader i sekvenseringsdjup mellan de två arrayerna, med 36.46 och 22.41 genomsnitt läser per plats för array 1 respektive array 2. Även om större djup bidrog till mer genomsnittliga läser per plats, det ökade inte den totala täckningen, med båda matriser som täcker 93.48% av de riktade regionerna till ett minimum av enfaldig täckning (kompletterande tabell 1b)., Detta tyder på att vårt infångningsförfarande framgångsrikt hämtat mallmolekyler från alla genomiska regioner tillgängliga via denna metod, och att djupare sekvensering inte skulle resultera i ytterligare data för co92 mallområden som inte omfattas av vår datamängd.

Figur 1: täckningsområden för genomiska regioner sekvenserade.

Genomarkitektur är känd för att variera mycket bland existerande Y. pestis strains12. För att extrapolera genordning i vår gamla genomet, vi analyserade läser kartläggning till co92 referens för alla extrakt som härrör från en enda individ som gav högsta täckning (individuell 8291). Trots den korta läslängden av våra gamla sekvenser och den mycket repetitiva naturen hos Y. pestis genomet extraherades 2,221 contigs matchande CO92, bestående av totalt 4,367,867 bp., För att identifiera potentiella regioner i det gamla genomet som är arkitektoniskt åtskilda från CO92, läser alla inte kartläggning till co92-referensen i sin tur övervägdes för contig-konstruktion. Efter filtrering för en minsta längd av 500 bp förblev 2,134 contigs innefattande 4,013,009 bp, varav 30,959 härrörde från omärkta läser. Konventionell BLAST sökning frågade mot CO92 genomet identifierade matcher för 2,105 contigs. Bevis på förändrad arkitektur identifierades i 10 contigs (Tilläggstabell 2). Ett exempel på en sådan strukturell variant visas i Fig., 2, där referensstyrd montering med omärkta läsningar för att spänna brytpunkten validerar dess rekonstruktion. Denna specifika genetiska läggning finns bara i Y. pseudotuberculosis och Y. pestis stammar Mictrotus 91001, Angola, Pestoides F och B42003004, som är föregångare till alla Y. pestis som vanligen förknippas med mänskliga infektioner (gren 1 och gren 2 strains13,14). Dessutom visar skillnader i arrangemanget av denna region i gren 1 och gren 2 moderna Y. pestis-stammar att omarrangemang inträffade som separata händelser på olika linjer.,

Figur 2: Anpassning av mappad rekonstruerade contigs mot CO92 och Microtus genom.

Enkelnukleotidskillnader mellan vårt gamla genom och co92-referensen bestod överraskande av endast 97 kromosomala positioner respektive 2 och 4 positioner i pCD1 respektive pMT1-plasmiderna (Tilläggstabell 3), vilket indikerar tätt genetiskt bevarande i denna organism under de senaste 660 åren. Tjugosju av dessa positioner var orapporterade i en tidigare analys av existerande Y., pestis diversity14 (Kompletterande Tabeller 3 och 4). Jämförelse av vårt gamla genom till dess förfader Y. pseudotuberculosis avslöjade att den medeltida sekvensen innehöll förfädernas nukleotid för alla 97 positioner, vilket indikerar att den inte har några härledda positioner frånvarande i andra Y. pestis-stammar. Två tidigare rapporterade kromosomala skillnader3 var inte närvarande i våra genomiska sekvensdata, vilket tyder på att de förmodligen härleddes från deaminerade cytosiner som skulle ha tagits bort i den nuvarande undersökningen via uracil-DNA-glykosylas-behandling före array capture.,

för att placera vårt gamla Genom i ett fylogenetiskt sammanhang karakteriserade vi alla 1 694 tidigare identifierade fylogenetiskt informativa positioner14 (Tilläggstabell 4) och jämförde de från vår gamla organism mot aggregerade basanropdata för 17 offentligt tillgängliga Y. pestis genomer och förfädernas Y. pseudotuberkulos. När de betraktas separat faller sekvenser från tre av de fyra offren endast två substitutioner från roten till alla existerande humana patogena Y. pestis-stammar (Fig. 3a), och de visar en närmare relation till gren 1 Y., pestis än till gren 2; en av de fyra offren (individuell 6330) var dock infekterad med en stam som innehöll tre ytterligare härledda positioner som ses i alla andra gren 1-genomer14. Detta tyder antingen på förekomst av flera stammar i London 1348-1350 pandemi eller mikroevolutionära förändringar som uppstår i en stam, vilket är känt för att inträffa vid sjukdomsuppfödningar15. Ytterligare stöd för Y., pestis microevolution indikeras av närvaron av flera variantpositioner för vilka sekvensdata från en individ visar två olika nukleotider vid jämförbara frekvenser (Tilläggstabell 5). Position 2896636 är till exempel en känd polymorf position i existerande Y. pestis populations14, och denna position visar det fasta härledda tillståndet i en individ (6330) och det polymorfa tillståndet i en annan (individuell 8291) vid minsta femfaldiga täckning (kompletterande Fig. 7). Detta ger ett anmärkningsvärt exempel på mikroevolution som fångats under en historisk pandemi., De återstående varianspositionerna är oförändrade i de 18 bevarade Yersinia genomerna, så de kan vara unika för den gamla organismen och är därför av ytterligare intresse. Ytterligare provtagning av gamla Genom kommer att bidra till att bestämma frekvensen av dessa mutationer i co-cirkulerande Y. pestis stammar, och kommer att klargöra uppkomsten av gren 2 stammar som ännu inte rapporterats i gamla prover.

Figur 3: fylogenetisk placering och historiskt sammanhang för East Smithfield-stammen.,

konsekventa trädtopologier producerades med flera konstruktionsmetoder och alla större noder stöddes av posterior probability (pp) värden på >0,96 och bootstrap värden >90 (Fig. 3b och kompletterande fikon 8 och 9). Träden placerar East Smithfield-sekvensen nära förfädernas nod av alla existerande mänskliga patogena Y. pestisstammar (endast två skillnader i 1 694 positioner) och vid basen av gren 1 (Fig. 3b)., Ett säkert Datum för East Smithfield-platsen 1348-1350 gjorde det möjligt för oss att tilldela en tipskalibrering till den gamla sekvensen och därmed datera divergenstiden för de moderna genomerna och East Smithfield-genomet med hjälp av en bayesisk strategi. Tidsmässiga uppskattningar indikerar att alla Y., pestis som vanligen förknippas med mänskliga infektion delade en gemensam förfader som levde någon gång mellan 668 och 729 år sedan (ad 1282-1343, 95% högsta sannolikhet densitet, HPD), som omfattar ett mycket mindre tidsintervall än nyligen publicerade estimates14 och ytterligare vilket tyder på att alla närvarande cirkulerar gren 1 och gren 2 isolat vuxit fram under det trettonde århundradet tidigast (Fig. 3B), eventuellt härrörande från en östasiatisk källa som tidigare föreslagits14., Detta innebär att den medeltida pesten var den viktigaste historiska händelsen som introducerade mänskliga populationer till förfadern till alla kända patogena stammar av Y. pestis. Detta ifrågasätter ytterligare etiologin för Justinianus sjätte till åttonde århundradet, som populärt antas ha resulterat i samma patogen: våra tidsmässiga uppskattningar innebär att pandemin antingen orsakades av en Y. pestis-variant som skiljer sig från alla för närvarande cirkulerande stammar som vanligtvis är förknippade med mänskliga infektioner, eller det var en annan sjukdom helt och hållet.

även om vårt tillvägagångssätt att använda en existerande Y., pestis referensmall för bete design utesluter vår förmåga att identifiera genomiska regioner som kan ha varit närvarande i den gamla organismen och förlorades därefter i CO92, genomiska jämförelser av vår gamla sekvens mot dess närmaste outgroups kan ge värdefulla insikter i Y. pestis evolution. Mikrotus 91001-stammen är den närmaste gren 1 och gren 2-släkting som har bekräftats vara icke-patogen för människan16, varför genetiska förändringar kan utgöra bidrag till patogenens anpassning till en mänsklig värd., Jämförelser mot denna grupp avslöjade 113 förändringar (Tilläggstabell 6a, b), varav många finns i gener som påverkar virulensassocierade funktioner som biofilmbildning (hmsT), järnförvärv (iucd) eller anpassning till den intracellulära miljön (phoP). På samma sätt, även om dess virulenspotential hos människor ännu inte har bekräftats enligt vår kunskap, har Y. pestis B42003004 isolerat från en kinesisk marmot-befolkning17 identifierats som stammen närmast förfädernas nod hos alla Y., pestis vanligtvis förknippas med mänsklig pest, och därmed kan ge viktig information om organismens utveckling. Fullständig genomjämförelse mot East Smithfield-sekvensen avslöjade endast åtta singelnukleotidskillnader (Tilläggstabell 6c), varav sex resulterar i icke-synonyma förändringar (Tilläggstabell 6d). Även om dessa skillnader förmodligen inte påverkar virulens, är påverkan av genförlust, genförstärkning eller genetiska omarrangemang,som alla är väl dokumenterade i Y. pestis12, 18, ännu obestämd., I senare evolutionära termer hittades singelnukleotidskillnader i flera kända patogenicitetsrelaterade gener mellan vårt gamla genom och co92-referenssekvensen (Tilläggstabell 3), vilket kan representera ytterligare anpassningar till mänskliga värdar.,

genom anrikning genom DNA-infångning i kombination med riktad hög genomströmning DNA-sekvensering har vi rekonstruerat ett utkast till genom för vad som är förmodligen den mest förödande mänskliga patogenen i historien och avslöjade att den medeltida pesten av det fjortonde århundradet troligen var ansvarig för dess införande och utbredd fördelning i mänskliga populationer. Detta indikerar att patogenen inblandad i den svarta döden har nära släktingar under det tjugoförsta århundradet som är både endemiska och framväxande19., Introduktioner av nya patogener till populationer är ofta förknippade med ökad förekomst och svårighetsgrad av sjukdomar20 och även om mekanismerna som styr detta fenomen är komplex21, kommer genetiska data från gamla infektionssjukdomar att ge ovärderliga bidrag till vår förståelse för host–pathogen coevolution. Den svarta döden är ett seminalt exempel på en framväxande infektion, reser över hela Europa och hävdar livet för en uppskattad 30 miljoner människor på bara 5 år, vilket är mycket snabbare än dagens priser av bubonic eller pneumonic pestinfektion22 och dissemination7, 8., Oavsett, även om ingen existerande Y. pestis-stam har samma genetiska profil som vår gamla organism, tyder våra data på att få förändringar i kända virulensassocierade gener har uppstått i organismens 660 års utveckling som en mänsklig patogen, vilket tyder på att dess upplevda ökade virulens i historien23 kanske inte beror på nya fasta punktmutationer som kan upptäckas via det analytiska tillvägagångssättet som beskrivs här., I vår nuvarande resolution anser vi att molekylära förändringar i patogener bara är en del av en konstellation av faktorer som bidrar till att förändra infektionssjukdomsprevalensen och svårighetsgraden, där genetiken hos värdpopulationen24, climate25, vektordynamik26, sociala förhållanden27 och synergistiska interaktioner med samtidiga sjukdomar28 bör vara främst i diskussioner om befolkningskänslighet för infektionssjukdomar och värdpatogenrelationer med hänvisning till Y. pestisinfektioner.

Lämna ett svar Avbryt svar