Upptäckten av SmacCas9
för Att ändra den fäderneärvda 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM specificitet SpyCas9, tidiga och senare rapporter har anställt en riktad evolution (exempelvis, ”VQR”, ”EQR”, ”VRER”, och ”NRNH” varianter) eller rationell design informerad av kristall struktur (exempelvis, ”QQR”, ”NG”, och ”NR” – varianter)17,18,19,20,21,22. Dessa rapporter fokuserade på PAM-kontakta arginin rester R1333 och R1335 som avskaffar funktion när uteslutande muterade., Medan dessa studier identifierade kompensatoriska mutationer som resulterade i förändrad PAM-specificitet, behöll Cas9-varianterna som de producerade en guaninpreferens i minst en position i PAM-sekvensen för rapporterad in vivo-redigering. Samtidiga rapporter har använt evolutionär information för att ytterligare slappna av den kanoniska 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) Pam specificitet av Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) eller att upptäcka alternativ 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) Pam specificitet till den kanoniska 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) PAM av Neisseria meningitidis CAS 923,24., Kärnorna från båda dessa nya rapporter föredrar dock fortfarande GC-innehåll i minst en position i PAM-sekvensen. Vi syftade till att lyfta sådana GC-content-förutsättningar via ett anpassat bioinformatiskt driven arbetsflöde som gruvor befintlig Pam-mångfald i Streptococcus genus25. Med hjälp av denna strategi, vi hemmastadda i den SmacCas9 som har potential att bära ändras icke-GC PAM specificitet på att anpassa 115 orthologs av SpyCas9 från UniProt (begränsat till de med större än 70% parvisa BLOSSOM62 betyg)., Anpassningen hittade vi SmacCas9 var en av två nära homologer, tillsammans med en Streptococcus mutans B112SM-EN Cas9 (SmutCas9), som har glutamines på båda positionerna anpassas till den annars mycket bevarad PAM-kontakta arginines (Fig. 1a–b; Kompletterande Fig. 2A). Argininrester är kända för att starkt föredra guaniner i aminosyrabasinteraktionslandskapet, vilket framgår av 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) specificitet av SpyCas9. Glutaminrester binds däremot företrädesvis till adeniner genom interaktion med det större spåret edge26., Vi hypoteser därför att SmacCas9 naturligtvis hade löst de nödvändiga kompensationsmutationerna för att få nytt adeninrik PAM-erkännande. En liten provstorlek på 13 distanser från dess motsvarande genom CRISPR-array hindrade oss från att med säkerhet dra slutsatsen SmacCas9 PAM i silico., Ändå stöddes möjligheten för SmacCas9 som krävde mindre GC-innehåll i sin PAM av sekvenslikheter till varianten ”QQR” som har 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) specificity27, förutom den At-rika putativa konsensuspam för FAG-ursprungsdistanser i CRISPR-arrayer associerade med mycket homologa SmutCas9, som identifierades med hjälp av vår tidigare beskrivna SPAMALOT-rörledning och i överensstämmelse med tidigare förutsägelser (Fig. 1C; kompletterande Fig. 2B, Kompletterande Fig. 3) 25,28.
en sekvens justering av SpyCas9, dess QQR variant, och SmacCas9. Steget i den understrykande röda linjen markerar sammanfogningen av SpyCas9 och SmacCas9 för att konstruera en SpyMac hybrid. Sekvenslogotypen (webblogo online tool) omedelbart under justeringen visar bevarandet vid 11 positioner runt de PAM-kontaktande argininerna i SpyCas9., B Domänorganisationen för SpyCas9 sammanlagd över en färgkodad struktur av RNA-guidad, målbunden SpyCas9 (PDB ID 5F9R). De två DNA-strängarna är svarta med undantag för ett magenta-segment som motsvarar PAM. En blå-grön-röd färgkarta används för märkning av Cas9 PI-domänen och guide spacer-sekvensen för att markera strukturer som ger sekvensspecificitet och förekomsten av kontakter inom domänen inom PI43. c en sekvens logotyp genereras online (webblogo) som var input med putative PAM sekvenser som finns i Streptococcus phage och i samband med nära SmacCas9 homologer.,
Engineering och Pam karakterisering av SpyMac
vi fortsatte att empiriskt bestämma Pam preferenser flera Streptococcus orthologs som ändrar en eller båda av de kritiska PAM-kontakter. Baserat på demonstrerade exempel på Pam-interaktionsdomänen (PID) och guide RNA (gRNA) som har korskompatibilitet mellan Cas9-ortoger som är nära besläktade och aktiva, konstruerade vi nya varianter genom att rationellt utbyta pi-regionen av katalytiskt ”död” SpyCas9 (dSpyCas9) med de valda orthologerna (kompletterande Fig., 2A–B)29,30. Monteras varianter, inklusive dSpyMacCas9 (här kallad dSpyMac), var separat cotransformed i E. coli-celler, tillsammans med guide RNA som härrör från S. pyogenes och en 8-mer PAM-biblioteket enhetlig bas representation i PAM-SCANR genetiska krets, som inrättades genom Leenay et al.31. Kretsen uppreglerar en grön fluorescerande protein (GFP) reporter i proportion till PAM-bindande styrka. Därför samlade vi GFP-positiva cellpopulationer genom flödescytometri (kompletterande Fig., 4) och Sanger sekvenserade dem runt Pam-platsen för att bestämma positionsvisa baspreferenser i en motsvarande variants PAM-erkännande. dSpyMac, mer så än dSpyMutCas9, genererade en spårprofil som var mest förenlig med guaninoberoende PAM-erkännande, tillsammans med en dominerande specificitet för adenindinukleotider (Fig. 2a; Kompletterande Fig. 2C).
ett kromatogram som representerar Pam-SCANR-baserad anrikning av variant-erkänner PAM-sekvenser från ett 5\(^{\prime}\) – nnnnnnn-3\(^{\prime}\) bibliotek. B SYBR-färgade agarosgeler som visar in vitro digestion av 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) substrat vid 16 minuters inkubation med 100 nM renade ribonukleoproteinenzymenheter. Pilar skiljer bandning av de klyvda produkterna från oblerat substrat (toppband)., Matrisdiagram sammanfattar klyvda fraktionsberäkningar, som utfördes i ett anpassat skript för bearbetning av gelbilder. Prover utfördes i oberoende biologiska dubbletter (n = 2). C tidskursmätningar av mål – DNA-substratklyvning för SmacCas9 och SpyMac. d DNA-substratet klyvning plottas som en funktion av 0,25: 1, 1:1, och 4: 1 molära förhållanden av ribonukleoprotein till målet för wild-typ SpyCas9 och hybrid SpyMac. Källdata tillhandahålls som en Källdatafil.,
därefter renade vi nukleasaktiva enzymer för att fortsätta sondera DNA-måligenkänningspotentialen och unikheten hos SpyMac. (Kompletterande Fig. 5a) 27,32. Vi inkuberade individuellt de ribonukleoproteinkomplexa enzymerna (bestående av Cas9 + crRNA + tracrna ) med dubbelsträngade målsubstrat av alla 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prime}\) – närliggande baskombinationer vid en adenindinukleotid PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); Fig. 2b)., En kort 16-min matsmältning anges både wild-type SmacCas9 och hybrid SpyMac klyvs i anslutning till 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) motiv mer brett och jämnt än den tidigare redovisade QQR variant. SpyMac utmärkte sig vidare med snabba DNA-skärningshastigheter som liknar Spycas9s snabba smältkinetik (Fig. 2C-D) 33. Vi sprang reaktioner som används varierande crRNA spacer längder och tracrRNA ordningsföljd, eftersom de senare skiljer sig något mellan S. macacae och S. pyogenes genom Kompletterande Fig. 5B–E)., Ingen av dessa två parametrar kompenserade för den långsammare klyvningshastigheten för SmacCas9, men vi märkte marginell förbättring av aktiviteten hos vildtypformen med sin inhemska tracrRNA, som komporerar med gränssnittet för guide-Cas9-interaktionen är mestadels utanför PI-domänen.
genomredigering med ispymac
en crispresso2 indel analys efter NGS av förstärkta genomiska regioner för att bedöma on-target redigering av iSpyMac i jämförelse med SpyMac och SpyCas9, på den angivna 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\) och 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^pam-sekvenser. Prover utfördes i två oberoende transfektionsreplikater (n = 2). B effektivitetsvärmekarta för felmatchningstoleransanalys av genomiska mål., Kvantifierade indelfrekvenser, som bedöms av Tide algorithm41, uppvisas för varje märkt enkel-eller dubbelmatchning i sgRNA-sekvensen för den angivna Cas9-varianten och indikerad PAM-sekvens. Prover utfördes i två oberoende transfektionsreplikater (n = 2). C CRISPResso2 genomisk basredigeringsanalys efter NGS av genomiska ampliconer för att bedöma omvandling av cytosiner till tyminer av iSpyMac-BE3. Prover utfördes i två oberoende transfektionsreplikater (n = 2). Alla källdata tillhandahålls som en Källdatafil.,
därefter utvärderade vi toleransen för iSpyMac till felmatchade sekvenser, genom att använda sgRNAs som hyser dubbla eller enkla missmatchningar till en fast protospacer inom AAVS-genen, som har en 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\) PAM-sekvens. ispymac visade redigeringsmöjligheter på mål med enstaka felmatchningar inom pam-proximala segmentet av sgRNA., För att mildra denna förmodade benägenhet för off-target introducerade vi r691a-mutationen, som tidigare isolerades via bakteriellt urval för SpyCas9 för att upprätthålla hög on-target-aktivitet samtidigt som vi reducerade off-target-redigering35. Vår HiFi-ispymac-variant, HiFi-ispymac, uppvisade nästan försumbar aktivitet på oöverträffade sekvenser, jämfört med det ursprungliga enzymet, med minimal förlust av on-target-aktivitet (Fig. 3b).,
Slutligen valde vi ett fönster av fyra nukleotider i VEGFA locus i en sekvens sådant sammanhang som alla andra CRISPR endonuclease med rapporterad användning för bas redigerar skulle inte tillåta att deras bas redigering med en cytidin deaminase-smält enzyme36. Därför har vi cotransfected HEK293T celler med en nickase form av iSpyMac härrör från den tidigare redovisade BE3 arkitektur för cytosin bas redigering (iSpyMac-BE3) och sgRNA plasmid riktar en PAM nedströms av den valda nucleotides5., Vi mätte effektiva basredigeringsnivåer i skördade celler, som uppvisade över 20% cytosin till tyminomvandling vid dessa positioner via ngs-analys (Fig. 3C).