Ätiologische Diagnose von Pneumokokkeninfektionen
Pneumokokken sind eine Hauptursache für Lungenentzündung und eine wichtige Ursache für Meningitis, Bakteriämie, Sepsis, Mittelohrentzündung, Rhinitis und Sinusitis . Klassisch wurde die ätiologische Diagnose dieser Infektionen durch Züchten des Mikroorganismus aus geeigneten Patientenproben durchgeführt.,
Die Identifizierung von Streptococcus pneumoniae aus Kultur hängt von der Beobachtung der morphologischen Eigenschaften sowohl der Bakterien als auch der Kolonien sowie von drei anderen phänotypischen Hauptmerkmalen ab, einschließlich Katalasenegativität, Gallenlöslichkeit und Optochinanfälligkeit. Die Anfälligkeit für Optochin ist eine Hauptstütze für die Identifizierung von Pneumokokken aufgrund der einfachen Durchführung des Tests, dessen Grundlage die Optochin-Hemmung der Pneumokokken-ATPase ist, ein Merkmal, das im Allgemeinen nicht von anderen Viridians-Streptokokken geteilt wird ., Die Entstehung optochinresistenter Varianten hat jedoch die Gültigkeit der Verwendung dieses einzigen Tests zur mutmaßlichen Identifizierung von Pneumokokken in Frage gestellt. Die Spezifität des Gallenlöslichkeitstests bleibt hoch und ist der genaueste Einzeltest zur Identifizierung von S. pneumoniae . Der Gallenlöslichkeitsphänotyp beruht auf der Aktivierung des hauptautolytischen Enzyms (einer vom lytA-Gen codierten N-Acetylmuramyl-l-Alanin-Amidase), das auch durch Natriumdeoxycholat erreicht werden kann., Es wurde festgestellt, dass einige Pneumokokkenisolate in Natriumdeoxycholat unlöslich sind , was Veränderungen im Hauptautolysin zugeschrieben wurde, aber die überwiegende Mehrheit der Pneumokokken bleibt gallenlöslich, was es zu einem äußerst genauen Test für die Pneumokokkenidentifikation macht.
Die Matrix-Assisted Laser desorption ionization-Time of flight Mass spectrometry (MALDI-TOF) bringt eine grundlegende Verschiebung bei der routinemäßigen Identifizierung von mikrobiellen Krankheitserregern in klinischen mikrobiologischen Labors mit sich ., Trotz des Erfolgs von MALDI-TOF bei der Straffung und gleichbleibend genauen Identifizierung, auch bei zuvor problematischen Organismen, war der Erfolg der derzeit verfügbaren Systeme bei der Identifizierung von S. pneumoniae schlecht . Das Massenprofil von MALDI-TOF-Systemen, die in klinischen mikrobiologischen Laboratorien eingesetzt werden, wird hauptsächlich durch ribosomale Proteine erzeugt, die die Ausrichtung auf aktuelle taxonomische Klassifikationen erleichtern. Allerdings, S., pneumoniae ist eine Klade innerhalb der evolutionär verwandten Mitis – Gruppe von Streptokokken, mit der sie viele Eigenschaften teilen kann, einschließlich ähnlicher ribosomaler Proteine . Daher ist die Unterscheidung durch MALDI-TOF zwischen S. pneumoniae und seinen weniger pathogenen Verwandten der Mitis-Gruppe schwierig. Kürzlich wurde argumentiert , dass diese Unterscheidung durch eine detailliertere Analyse der Massenprofile möglich sein könnte, und darauf folgte eine Veröffentlichung, in der über den Erfolg eines kommerziell erhältlichen Systems zur Unterscheidung von S. pneumoniae von anderen Arten der Mitis-Gruppe berichtet wurde ., Diese ermutigenden Entwicklungen können zu einer Vereinfachung der routinemäßigen Identifizierung von S. pneumoniae in klinischen mikrobiologischen Laboratorien führen.
Die Fähigkeit, ein Kapselpolysaccharid (CPS) zu produzieren, ist auch ein Kennzeichen von Pneumokokken. Die Kapsel kann durch verschiedene Mikroskopietechniken visualisiert werden, aber bei Pneumokokken wird das Vorhandensein eines CPS normalerweise unter Verwendung spezifischer Seren nachgewiesen . Das Statens Serum Institut in Kopenhagen, Dänemark, ist die häufigste Quelle für Seren zur Identifizierung von Pneumokokkenkapseln., Sie liefern ein „Omni-Serum“, das mit allen bekannten Pneumokokkenkapseln reagiert und bei der Identifizierung von Pneumokokken nützlich sein kann, sowie spezifische Seren, die nur mit bestimmten Polysacchariden oder Gruppen von Polysacchariden reagieren . Nicht eingekapselte Pneumokokken sind bekannt und wurden häufig mit Konjunktivitisausbrüchen in Verbindung gebracht . Da die Herstellung eines CPS jedoch ein so bestimmendes Merkmal von Pneumokokken ist, wurden diese besonders strengen Tests unterzogen, um ihre Identifizierung als S. pneumoniae zu bestätigen .,
Die Identifizierung des Pneumokokken-CPS durch den Quellung-Effekt oder Neufeld-Test unter Verwendung spezifischer Kaninchenseren ist eine bewährte Technik, die seit den frühen Tagen der Pneumokokken-Serotypisierung angewendet wird . Diese Technik erfordert jedoch spezifisches Fachwissen, so dass das Statens Serum Institut in jüngerer Zeit einen Latex-Agglutinationstest zur Verfügung gestellt hat, der ein optimierteres Verfahren zur Serotypisierung von Pneumokokken ermöglicht . Um diesen Prozess weiter zu vereinfachen, wurden mehrere „genetische Serotypisierungsschemata“ entwickelt, um bestimmte Merkmale der CPS-Loci zu identifizieren., Trotz der Vielzahl von Ansätzen basieren die am weitesten verbreiteten Ansätze auf der PCR-Amplifikation spezifischer Serogruppen-oder Serotypgene . Tatsächlich wurden sowohl konventionelle als auch Echtzeit-PCR-Verfahren entwickelt, und es wurde eine große Vielfalt von Schemata vorgeschlagen, um den Unterschieden in der Prävalenz der verschiedenen Serotypen in verschiedenen geografischen Regionen Rechnung zu tragen ., Obwohl die genetische Serotypisierung die Serotypisierung einer größeren Anzahl von Laboratorien zur Verfügung gestellt und zur Klärung unklarer Reaktionen beigetragen hat, bleiben phänotypische Methoden der Goldstandard für die Pneumokokken-Serotypisierung , und aus diesem Grund wurden auch hybride Ansätze entwickelt, an denen sowohl PCR-als auch monoklonale Antikörper beteiligt sind ., Vielleicht sind die klarsten Beispiele dafür Isolate, bei denen der Kapselort Punktmutationen oder Einfügungen enthält, die zur Abwesenheit der Expression eines CPS führen (van der Linden und Ramirez, unveröffentlichte Daten), denen jedoch ein Serotyp nach genetischen Serotypisierungsschemata zugewiesen würde.
Neuere Methoden, die sich auf den Nachweis mikrobieller Komponenten stützen, werden bei der Diagnose von Pneumokokkeninfektionen immer wichtiger ., Der immunochromatographische Nachweis von C-Polysaccharid (Teichsäure) im Urin hat die Diagnose einer Pneumokokken-Pneumonie bei Erwachsenen erheblich verbessert, obwohl bei Kindern die hohe Häufigkeit der Pneumokokken-Beförderung zu einer unzureichenden Spezifität des Tests führt . Der Test wird auch für den Einsatz in CSF validiert, was zu einer verbesserten ätiologischen Diagnose von Meningitis führt ., Es gibt zunehmend Beweise für die Nützlichkeit des Tests beim Nachweis von Pneumokokken in Pleuraflüssigkeit bei Kindern und Erwachsenen , aber es gibt viel weniger Informationen über seine Verwendung bei bronchoalveolärer Lavage , bei nasopharyngealen Aspiraten oder in Blutkulturmedien , wo es zum Nachweis von Pneumokokken verwendet werden kann, die nicht mehr lebensfähig sind.
In jüngerer Zeit wurde der Nachweis von Pneumokokken-DNA für die Diagnostik verwendet. Zu diesem Zweck wurde die Amplifikation von für S. pneumoniae spezifischen Genfragmenten wie lytA, ply, psaA, cpsA (wzg) oder spn9802 durch PCR verwendet., Real-time-PCR-Methoden wurden gezeigt zu werden mehr empfindlich als die konventionelle PCR, aber auch andere Variationen, einschließlich der Detektion der PCR-Produkte mit Perlen, mikroarrays, oder die Größe der Fraktionierung wurden auch entwickelt . Die Kombination der DNA-Amplifikation zur Identifizierung mit den oben diskutierten genetischen Serotypisierungsansätzen ermöglicht die Identifizierung des Serotyps des Stammes ohne die Notwendigkeit einer Kultur . Die Verwendung dieser Methoden bei parapneumonischen Ergüssen oder Empyemen ist gut dokumentiert und erhöht den ätiologischen diagnostischen Ertrag gegenüber Kultur erheblich .,
Es besteht großes Interesse, diese Methoden zum Nachweis von Pneumokokken im Blut bei Lungenentzündung bei Kindern und Erwachsenen anzuwenden . Die hohe Beförderungsrate von Pneumokokken bei Kindern könnte jedoch ein wichtiger Konfounder sein, indem die Zirkulation von Pneumokokken-DNA in gesunden Trägern nachgewiesen wird . Zwei Studien haben sich speziell mit diesem Thema befasst, mit widersprüchlichen Ergebnissen . Andere Studien zeigen, dass die geschätzte Pneumokokkenlast im Blut mit dem Schweregrad der Erkrankung korreliert und möglicherweise zur Unterscheidung zwischen Besiedlung und Infektion verwendet werden könnte .,
Ein ähnlicher Ansatz wurde bei den häufiger verfügbaren Atemproben wie Sputum befürwortet. Der Wert von Sputum bei der Diagnose einer Lungenentzündung wurde auch im Kontext herkömmlicher Kulturmethoden ausführlich diskutiert. Obwohl argumentiert werden kann, dass das Fehlen von Pneumokokken es möglicherweise als ätiologisches Mittel ausschließen könnte, eine Hypothese, die sicherlich weitere Studien rechtfertigt, könnte ihr Nachweis entweder auf eine Infektion oder eine asymptomatische Beförderung zurückzuführen sein ., Bei Erwachsenen wurde die Quantifizierung von Pneumokokken oder Pneumokokken-DNA im Sputum vorgeschlagen , um zwischen Kolonisation und Krankheit zu unterscheiden, dies kann jedoch durch die Variabilität der Assays und das Fehlen klarer Kriterien zur Definition von Grenzwerten selbst in Proben guter Qualität erschwert werden . Bei Kindern wurden ähnliche Ansätze vorgeschlagen, aber der diagnostische Wert dieses Ansatzes wird durch die Tatsache in Frage gestellt, dass viele Kinder von Pneumokokken mit sehr hohen Dichten besiedelt sind., Die Überwachung zweier wichtiger Wirtsmarker, C-reaktives Protein und Procalcitonin, scheint die Spezifität von PCR-Assays bei der Diagnose einer Pneumokokkeninfektion der unteren Atemwege zu erhöhen . Trotz dieser Unsicherheiten bieten mehrere handelsübliche Assays bereits den Nachweis von Pneumokokken-DNA für diagnostische Zwecke .,
Obwohl traditionelle mikrobiologische Methoden, einschließlich der neueren Antigen-Nachweismethoden, in vielen Labors für die Diagnose von Pneumokokkeninfektionen die Hauptstütze bleiben werden, werden neuere molekulare Methoden zweifellos immer wichtiger. Die verstärkte Anwendung molekularer Tests hängt von der Klärung der Relevanz für die Identifizierung von Infektionen und dem Nachweis von Beweisen für das Vorhandensein bakterieller Produkte in menschlichen Proben ab. Dies wird besonders für Atemproben, bei denen die Debatte noch andauert, selbst für die traditionelleren Ansätze kompliziert sein., Angesichts unseres zunehmenden Verständnisses der Beziehungen zwischen mehreren Krankheitserregern in den oberen Atemwegen, die ihre Fähigkeit zur Infektionsursache beeinträchtigen können, werden molekulare Ansätze zur Erkennung mehrerer Krankheitserreger zweifellos immer wichtiger in der ätiologischen Diagnose von Atemwegsinfektionen .