O Identificarea de Elemente ESTE în E. coli
ESTE elemente au fost detectate pentru prima dată de efectele cauzate dacă aceste elemente sunt integrate în lac (Malamy, 1966, 1970) și gal operons (Saedler și Starlinger, 1967a,b; Iordan et al., 1967; Adhya și Shapiro, 1969) de E. coli și în operonul timpuriu al bacteriofagului lambda (Brachet et al., 1970)., Elementele provoacă o mutație nulă a genei în care se integrează și un efect polar foarte puternic asupra tuturor genelor operonului localizat distal față de gena mutantă. Mutațiile revin spontan la tipul sălbatic, dar frecvența reversiunii nu a putut fi sporită de mutageni. Acest lucru a ridicat suspiciunea că mutațiile nu au fost mutații punctuale, ci rearanjări ale ADN-ului.,s-ar putea demonstra că mutația a adăugat ADN la operonul gal prin compararea densității bacteriofagului lambda dgal care a efectuat sau nu mutația și a fost altfel izogen (Jordan et al., 1968; Shapiro, 1969). Aceasta a exclus posibilitatea ca mutațiile să fie cauzate de o inversare a ADN-ului. Pentru a distinge între cele două posibilități rămase, duplicarea unei părți a operonului gal sau inserarea în acest operon a ADN-ului fără legătură, Michaelis și colab., (1969) a comparat ADN-ul mutant și cel nemutat prin hibridizarea ARN transcris de la mutant la ADN. Aceste experimente au arătat clar că ADN-ul suplimentar găsit în mutanți nu a fost derivat din operonul gal. În plus, s-ar putea demonstra că ADN-ul suplimentar în doi mutanți independenți a împărtășit cel puțin unele dintre aceste secvențe. Acest lucru a ridicat posibilitatea ca mutanții să nu fie cauzați de Inserarea unor segmente aleatorii de ADN E. coli, ci mai degrabă de transpunerea unor elemente transpozabile specifice.,această ipoteză s-a dovedit a fi adevărată, când un număr mai mare de mutanți au fost investigați prin introducerea moleculelor de ADN heteroduplex în microscopul electronic (Fiandt et al., 1972; Hirsch și colab., 1972a, b; Malamy și colab., 1972). Patru elemente diferite ar putea fi identificate la acel moment. Acestea au fost numite secvențe de inserție (IS) și numerotate consecutiv IS1 prin IS4. IS1 are o lungime de aproximativ 0,8 Kb (kilobaze). Celelalte elemente au o lungime de aproximativ 1,5 Kb. Un al cincilea element, IS5, de dimensiuni similare (Blattner et al.,, 1974) și un element mai mare de puțin mai mult de 5 Kb, care din motive istorice se numește γ-δ(Guyer, 1978), au fost detectate de atunci, dar numărul pare să fie aproape de saturație pentru E. coli K12.
în cadrul limitării microscopului electronic, diferitele elemente IS nu împărtășesc secvențe, în timp ce izolatele diferite ale aceluiași element sunt identice. Desigur, acest lucru nu exclude diferențele mici de secvență între acestea din urmă.,
Hibridizare corespunzătoare ADN-ul singur fire de partajare numai, ESTE elementul în formă complementară, urmată de digestia cu single-strand-specifice nucleaze permite izolarea ADN-ul ESTE în formă pură (Ohtsubo și Ohtsubo, 1976; Schmidt et al., 1976). Dezvoltarea rapidă a ADN-ului restricție de analiză și metode de secvențiere au, într-adevăr, au permis determinarea de a finaliza secvența de IS1 (Ohtsubo și Ohtsubo, 1978; Johnsrud, 1979), și IS2 (Ghosal et al., 1979a). Secvența IS4 este aproape de finalizare la momentul scrierii acestui capitol (R. Klaer și colab., experimente nepublicate).,tehnicile de hibridizare ADN–ADN au fost folosite pentru a căuta prezența elementelor IS în cromozomul E. coli. IS1 și IS2 sunt prezente în ∼8 și ∼5 exemplare, respectiv (Saedler și Heiss, 1973). Utilizarea tehnicii Southern blotting a permis determinarea exactă a numărului de copii al IS3 în E. coli K12 și al IS4 . În plus, unele dintre elementele IS s-au dovedit a fi purtate pe plasmida f a fertilității E. coli (Davison et al., 1975a)și pe unii factori R (Hu et al., 1975).,
elementele IS nu sunt cunoscute pentru a codifica genele care sunt traduse în proteine, deși în cazul IS1 secvența ADN cunoscută nu exclude posibilitatea traducerii într-o peptidă (câteva) de dimensiuni limitate. Lungimea elementelor IS exclude formarea de proteine mari. Efectele cunoscute ale elementelor IS sunt, prin urmare, limitate la poziția, unde sunt integrate și la secvențele ADN adiacente în poziția cis. Aceste efecte sunt descrise în secțiunile următoare.o altă clasă de elemente ADN transpozabile a fost descrisă încă din 1974., Ele sunt numite transpozoane. De regulă, ele sunt mai mari decât elementele IS și sunt detectate prin efecte care sunt cauzate de proteina codificată în ADN-ul transposon. Primii transpozoni descriși codifică rezistența la antibiotice, iar majoritatea transpozonilor cunoscuți poartă gene de rezistență (Datta et al., 1971; Hedges și Jacob, 1974; pentru RECENZII, Vezi Cohen, 1976; Kleckner, 1977). Există, totuși, transpozoni care codifică o enterotoxină E. coli (So et al., 1979), sau gene pentru fermentarea lactozei (Cornells et al., 1979)., Tn3, pe lângă faptul că poartă o genă pentru β lactamază, poartă și gene implicate în procesul de transpunere (Heffron et al., 1977; Gill și colab., 1978; Chou și colab., 1979). Același lucru pare să fie valabil și pentru Tn5 (Berg et al., 1978).transpozonii se găsesc în natură ca părți ale plasmidelor. Transpunerea între plasmide explică variabilitatea constatată în ceea ce privește rezistența multiplă la medicament a diferitelor plasmide. În laborator, a fost detectată transpunerea la genomul bacteriofagului, precum și transpunerea la cromozomul bacterian., Cu toate acestea, niciunul dintre transpozonii cunoscuți nu este un constituent natural al cromozomului E. coli K12.literatura despre transpozoane se extinde rapid, iar pentru o descriere a multor transpozoane diferite cunoscute la momentul redactării acestui articol, cititorul este referit la recenzii mai cuprinzătoare ale acestui subiect.toți transpozonii investigați până acum au o structură comună: poartă o secvență ADN repetată la termini și gene unice care codifică ADN între aceste secvențe ADN repetate. În cele mai multe cazuri, secvențele ADN repetate sunt inversate unul față de celălalt., Dimensiunea lor este variabilă. În unele transpozoane repetările inversate sunt de aproximativ 1,5 Kb, și există motive să se suspecteze că aceste secvențe sunt transpozabile în mod independent elemente IS. În alte cazuri, ADN-ul repetat este de numai aproximativ 0,15 Kb (de exemplu, Tn1–3, care codifică rezistența la ampicilină (Heffron et al., 1975; Kopecko și Cohen, 1975).
În cazul Tn9, codifică rezistența la cloramfenicol (McHattie și Jackowski, 1977), și Tn1681, codare E. coli enterotoxină (Deci et al., 1979), secvența repetată la termini este IS1., În ultimul caz, cele două copii ale IS1 sunt inversate relativ unul față de celălalt, în timp ce în primul caz cele două copii IS1 sunt repetiții directe. După cum se știe din secvența ADN a lui IS1 că acest element în sine este terminat de mici repetiții ADN nepotrivite, regula generală că însăși terminalele transpozonilor sunt repetiții inversate este conservată chiar și pentru Tn9. Într-adevăr, în cazul IS2 (Ghosal et al., 1979A) și IS4 (Habermann et al., 1979), repetările inversate se găsesc la termini., Generalitatea acestei observații poate implica chiar un rol al acestor repetări inversate în procesul de transpunere.