Verificarea Experimentală de Modele
prima abordare (3) a identificat primare de inițiere site-uri în 14 proteine, inclusiv bovine pancreatic RNase O si sperma de balena mioglobina, și, de asemenea, alte mai puțin stabil inițierea site-uri (11) în RNase A. primar site-ul de deschidere pentru RNase Un fost identificate în acest model ca reziduuri 106-118. Aplicarea celei de-a doua abordări (8) la RNase A (13) a condus la șase site-uri (ilustrate în Fig., 3 a), care erau în concordanță cu cele identificate (11) prin prima abordare (3). Acestea sunt reziduuri 4-11 (O regiune), reziduuri de 25-34 de ani (zona B), reziduuri 51-57 (regiunea C), și antiparalel structuri (nu neapărat cutat foi) format de către asociația de reziduuri 53-67 cu reziduuri 69-79 (regiunea D), reziduuri 71-90 cu reziduuri 91-111 (regiunea E), și reziduuri 103-111 cu reziduuri 115-124 (regiunea F). Etapele ulterioare de-a lungul căii de pliere constau în creșterea sau coalescența acestor regiuni. Regiunea G se formează atunci când reziduurile 36-48 ori împotriva helix B., Regiunea G, cu toate acestea, conține mai-gama de contact decât are helix B. prin Urmare, G este considerat a forma într-o etapă ulterioară decât B. Regiunea L este format prin asociere din regiune a cu B, G și C. Acest structurale secvență este urmată de regiunea Sec, format atunci când regiunile C și D, care vin în contact; de regiune K conțin contacte între regiuni, E și F; prin regiunea J regiunile în care C și D formular de contact cu regiunile E și F; și de regiune nu conțin contacte de regiuni E și H cu G. în cele din Urmă, regiunea M se formează atunci când O regiune care vine în contact cu E și F.,
prezis primar pliere site-ul de deschidere de Rnază a este în acord cu cele observate transforma în reziduuri 113 și 114 din moleculei native, cu grad foarte ridicat de conservare a nepolare reziduuri în site-ul 106-118 de 23 specii de mamifere acestei proteine (3), și cu date experimentale privind intermediarii detectat în termică desfășurarea de Rnază A (14)., RMN dovezi pentru structura locală în desfasurata RNase O sub pliere condiții (15) și din fragmente ale acestora (16), și imunochimice studii privind formarea stabil antigenic site-uri (pe suprafața de proteine, care acoperă îngropat primar hidrofobe site-ul de deschidere, atunci când a redus RNase O este oxidat (ref. 17 și figura 8 din ref. 18), au fost, de asemenea, în concordanță cu această imagine. Alte dovezi experimentale care susțin existența siturilor de inițiere A-F sunt furnizate în ref. 11.,
Pentru apomyoglobin, prima abordare (3) identificate primar pliere site-ul de inițiere ca reziduuri 103-115, care cuprinde cea mai mare parte a G helix, cu secvența Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-de-Ile-Lui-Val Lei., Cererea de cea de-a doua abordare (8), și conformaționale-calculele de energie, a condus la sugestia că interacțiunile dintre O, G și H elice de apomyoglobin ar putea fi important pentru pliere inițiere (19), în concordanță cu rezultatele experimentale care a implicat aceste regiuni în echilibru intermediari de apomyoglobin (20) și în primele cinetică pași în plierea cale (21). Studiile experimentale recente ale mutanților mioglobinei (22, 23) oferă un suport convingător pentru modelele care încorporează inițierea hidrofobă și propagarea pliării.,
Apomyoglobina a devenit o paradigmă pentru cercetarea căilor de pliere (24). O parte din apomyoglobin moleculă, format din O, G și H elice și o parte din B helix, falduri rapid pentru a forma o cale intermediară, cu restul de lanț polipeptidic pliere într-un ritm mai lent, de ordinul a câteva secunde (21, 25). Fragmente peptidice de apomyoglobin corespunzătoare G și H helixuri a arătat o tendință de structură elicoidală (26-28), întrucât peptide corespunzătoare pentru restul de proteine arătat mult mai mică înclinație pentru helix formarea (29)., Cu toate acestea, un experiment în care helixul H al mioglobinei a fost mutat pentru a-și reduce înclinația elicoidală (30) a arătat o influență foarte mică asupra ratei de pliere a proteinei. Un efect mult mai mare a fost observat atunci când histidina distală (H64) a fost schimbată în fenilalanină: înlocuirea unui lanț lateral nepolar pentru histidina polară îngropată a dus la o creștere semnificativă a ratei de pliere (31). Aceste studii au subliniat importanța ambalării lanțului lateral, în special în suprafețele de contact ale helicelor, pentru rata de pliere a apomioglobinei.,Apomyoglobina are avantajul că poate fi studiată la echilibru sub o serie de condiții de soluție care aproximează unele dintre etapele observabile pe calea de pliere cinetică. Astfel, a fost posibilă definirea înclinațiilor conformaționale ale apomioglobinei desfăcute și parțial pliate prin RMN (32-35). Interesant, acid desfășurat apomyoglobin arată o predilecție pentru non-nativi structură elicoidală într-o regiune care se conectează D și E helixuri, precum și nativ-ca structura observată în O și H elice, care a fost prezis în studii cinetice (34)., RMN studii de conformaționale predispoziții de diferite forme de apomyoglobin (32-35) a inclus determinarea relaxare parametrii lanț polipeptidic la site-specific determina dinamica vertebrală în fiecare dintre statele din proteine. În locul analizei „fără model” care este potrivită pentru proteinele pliate, datele de relaxare au fost analizate prin calcularea funcțiilor de densitate spectrală redusă J(0), J(wN) și J(wH) (36). Funcția J (0) informează despre mișcările scalei de timp µs–ms și a sugerat că, pentru apomioglobină la pH 2.,3, helicele A și G făceau contacte tranzitorii (34). Acest rezultat interesant, validat ulterior de studiile RMN cu etichetă spin (37), a furnizat dovezi definitive ale contactelor native cu rază lungă de acțiune într-o proteină desfășurată. Și mai intrigant, funcția J(wN), care informează despre mișcarea scării de timp ps–ns, a arătat o variație dependentă de secvență, care ar putea fi corelată cu variația unui parametru calculat, „zona medie îngropată la pliere” (AABUF) (10)., Acest parametru, care încorporează atât reziduuri de mărimea și caracterul hidrofob, este definit de aminoacizi individuali, dar este, de obicei, în medie pe o fereastră de la cinci la nouă reziduuri în secvență și oferă o alternativă de estimare cantitativă a hidrofob definite prin Matheson și Scheraga (3) în ceea ce privește energia liberă de formare. În cazul apomyoglobinei la pH 2,3, vârfurile din graficul J (wN) vs., numărul reziduurilor, care indică restricționarea mișcării scării de timp sub-ns, corespundea extrem de bine cu vârfurile din parcela AABUF, care indică un număr mai mare decât media de aminoacizi mari și/sau nepolari. Această observație a sugerat că există un model în secvența de aminoacizi, definită prin grupări de lanțuri laterale mari și/sau nepolare, ca în modelul ref. 3, ceea ce duce la restricționarea mișcării coloanei vertebrale polipeptidice cauzată de formarea clusterului hidrofob local.
Apomioglobina la pH 2.,3 păstrează o mică înclinație pentru structura elicoidală în helicele A și H, după cum reiese din schimbările chimice observate ale RMN (34). Aceste înclinații sunt eliminate în prezența de 8 M uree (35), dar secvența dependența de relaxare ratele de uree-denaturat apomyoglobin arată, de asemenea, o interesantă corelație cu AABUF parametru. În acest caz, corelația este între minima în J(wH) și un maxim de AABUF, sugerând că autoritățile locale interacțiuni hidrofobe care restricționează vertebrală mișcare pe sub-ns scale de timp sunt persistente chiar și în 8 M uree.,
Pentru a testa ipoteza că AABUF parametru, și anume, caracterul hidrofob, ar putea fi folosit pentru a prezice pliere inițierea site-uri în lanț polipeptidic, un set specific de apomyoglobin mutații s-au făcut (23). Un helix, care participă în cinetică intermediară, care este format în primul rând la pliere a WT apomyoglobin, are o secvență care dă naștere la un maxim în AABUF parametru, întrucât E helix, care este, de fapt, foarte hidrofobe potrivit convenționale hidrofob solzi, are o destul de scăzut AABUF de-a lungul lungimii sale., În apomyoglobina pliată, lanțul lateral al Trp-14, în helixul A, se află vizavi de coloana vertebrală a helixului e la Gly-73. A fost pregătită o mioglobină dublă mutantă, în care Trp-14 a fost înlocuit cu Gly, iar Gly-73 a fost înlocuit cu Trp. S-a motivat că structura pliată a proteinei ar trebui să fie perturbată minim de acest swap, dar că parametrul AABUF pentru helicele A și E ar trebui să fie afectat drastic. Întrebarea era dacă calea de pliere ar fi, de asemenea, afectată. Într-adevăr, plierea mutantului în care G73 și W14 sunt schimbate are loc printr-o cale diferită de proteina WT., Toate variantele de apomioglobină care au fost studiate până în prezent se pliază printr-un intermediar de fază de spargere care conține structură elicoidală. În cazul apomyoglobinei WT, acest intermediar conține helicele A, G și H (și, de asemenea, o parte a helixului B). În mutantul swap G73–W14, intermediarul conține helicele E, G și H; helixul A nu este protejat în faza inițială de pliere, ci se pliază mai târziu. Acest rezultat (ilustrat în Fig. 4) a fost confirmată de studiile spin-label care arată contactele dintre helicele E, G și H în mutant, mai degrabă decât contactele A, G și H observate în proteina WT.,