Cancer se referă la un complex și de grup heterogen de boli caracterizate prin necontrolate și dezordonat proliferarea de celule, care de multe ori dobândi capacitatea de a invada alte țesuturi. Cancerul își are originea, de obicei, în celulele somatice care, ca o consecință a unei serii de mutații genetice, evită mecanismele care reglează homeostazia țesuturilor, cum ar fi inhibarea contactului celulă-celulă, semnalele de diferențiere și inducerea morții celulare., Mutațiile responsabile de transformarea tumorii se referă la două grupuri principale de gene, cunoscute sub numele de proto-oncogene (stimulatori ai ciclului celular) și supresori tumorali (represori ai progresiei ciclului celular). Aceste modificări funcționale pot apărea ca o consecință a mutațiilor nucleotidice unice, dar pot fi cauzate și de modificări mai mari ale materialului genetic, cum ar fi inserții, ștergeri, duplicări sau translocări ale unui fragment cromozomic. Aceste anomalii în celulele canceroase pot fi folosite ca biomarkeri tumorali., Cuantificarea modificărilor numărului de copii genice sau a rearanjamentelor genice este esențială pentru înțelegerea biologiei tumorale, de aici importanța testelor genetice bazate pe profilarea citogeneticii moleculare.
Figura 1: Etichetarea probe ADN pentru analiza FISH.
ce este peștele ?
hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) este o tehnică citogenetică utilizată pentru detectarea și localizarea secvențelor nucleotidice (ADN sau ARN) în țesuturi sau celule., Peștele poate fi utilizat pentru „cartografiere” materialul genetic din celulele umane, oferind informații cu privire la localizarea, lungimea și numărul de copii ale genelor specifice sau porțiuni cromozomiale. Necesită sinteza unei sonde marcate fluorescent, care este o secvență de acid nucleic legată de o moleculă reporter fluorescentă, care apoi se va lega (hibridiza) la o secvență țintă specifică. Sondele de pește pot fi etichetate prin diferite metode (de exemplu, traducerea nick, amorsarea aleatorie), pornind de la diferite intrări de acizi nucleici, cum ar fi ADN/ARN genomic, cromozomi artificiali bacterieni (BACs) sau cosmide.,
primul pas în procesul de pește este imobilizarea metafazelor cromozomiale sau a celulelor interfazice care conțin ADN-ul țintă pe o lamelă de sticlă. Apoi, atât specimenul ADN, cât și sonda de pește sunt denaturate de căldură. Atunci când sonda este în contact cu materialul genetic țintă, se va lega în mod specific la secvența complementară pe cromozom. Hibrizii formați între sonde și țintele lor de secvență pot fi apoi vizualizați folosind un microscop fluorescent (Figura 1)., În general, două tipuri de PEȘTE sonde pot fi distinse: cromozomul enumerare sonde (CEPs sau CENs) vizează pericentromeric regiuni ale cromozomului și utilizate pentru a enumera cromozomi; și locus-indicatori specifici (LSI) în special recunoașterea gene de interes.
Figura 2: Exemplu de PEȘTE rezultate: Nick Traducere ADN Sistem de Etichetare 2.0 a fost folosit pentru a eticheta BAC probe ADN pentru TP53 cu SEEBRIGHT® Orange 552 dUTP și BAC probe ADN pentru Centromerului 17 cu SEEBRIGHT® Verde 496 dUTP., Sondele etichetate au fost hibridizate la răspândirea metafazei. (Institut Universitaire du Cancer Toulouse Oncopole)
PEȘTE are mai multe avantaje față de alte tehnici citogenetice clasice, cum ar fi G-banding cariotiparea. În primul rând, are o rezoluție mai mare (20-150KB vs 5MB). În plus, peștele poate fi aplicat atât metafazei, cât și cromozomilor interfazici, ceea ce înseamnă că celulele nu trebuie cultivate timp de câteva zile înainte ca cromozomii să poată fi pregătiți pentru analiză., Acest lucru implică, de asemenea, că peștele este potrivit pentru analiza diferitelor tipuri de probe, inclusiv tumori solide și țesuturi încorporate în parafină fixă cu formalină (FFPE). În plus, sondele de pește pot fi etichetate cu fluorofori diferiți, permițând monitorizarea simultană a mai multor site-uri.
PESCUIT Aberații Cromozomiale în Cancer
Datorită versatilității sale, PEȘTE pot fi utilizate pentru analiza citogenetica a ambelor tumori solide (de exemplu, cancer de san, non-cancer pulmonar cu celule mici, cancer colorectal) și hematologice sau cancer al sângelui (de exemplu, leucemie, limfoame, mielom multiplu)., Detectarea anomaliilor genetice este utilă nu numai pentru cancer, ci și ca instrument de analiză a predispoziției genetice și a informațiilor specifice bolii și pentru a prezice un rezultat chimioterapeutic.
pește pentru cancerul pulmonar
cancerul pulmonar este cel mai frecvent diagnosticat și principala cauză a deceselor legate de cancer. În special, cancerul pulmonar cu celule non-mici (NSCLC) reprezintă ~80-85% din toate cancerele pulmonare. Mutațiile somatice asupra genelor EGFR și ALK sunt adesea asociate cu NSCLC., EGFR (receptorul factorului de creștere Epidermal) este o clasă de receptori de tirozin kinază a căror activitate este dereglată în diferite tipuri de tumori maligne epiteliale (inclusiv cancerul pulmonar), deoarece acestea joacă un rol important în proliferarea celulelor canceroase, angiogeneza și metastazele. Din acest motiv, diferite strategii pentru a interfera cu funcția EGFR sunt exploatate în mod obișnuit pentru terapia pacienților. Inhibitorii activității tirozin kinazei acestor receptori (de exemplu erlotinib, gefitinib) sunt utilizați pe scară largă în tratamentele clinice NSCLC., Din păcate, datorită varietății mutațiilor genetice care stau la baza disfuncției EGFR, unii pacienți sunt insensibili la acest tip de tratament. Diferitele grupuri de pacienți pot fi într-adevăr diferențiate în funcție de tipul de modificare efectuată de EGFR, cum ar fi amplificarea genelor, deleția sau substituțiile cu un singur nucleotid, care își pot modifica activitatea în moduri diferite (adică nu prin domeniul tirozin kinazei). Drept urmare, numărul de copii EGFR determinat de FISH este unul dintre biomarkerii utilizați pentru a selecta terapia corectă.,
peștele este utilizat în mod obișnuit pentru a detecta inversiuni sau translocații în gena ALK. Gena ALK este localizată pe brațul scurt al cromozomului 2 (2p23) și codifică receptorul transmembranar al tirozin kinazei. ALK nu trebuie exprimat în plămânul adult. Cu toate acestea, în condiții patologice, gena ALK rupe și fuzionează 3′ (care conține domeniul tirozin kinazei) cu 5′ din alte gene. Acest eveniment poate duce la activarea necontrolată a căilor de semnalizare ALK în aval. Cea mai frecventă fuziune are loc cu EML4, din cauza unei inversiuni pe brațul scurt al cromozomului 2.,
FISH este metoda aprobată de FDA pentru a detecta inversiuni sau translocații în gena ALK. De obicei, sondele care vizează regiunea 3′ și 5 ‘ a genei sunt etichetate cu fluorofori diferiți: în nucleele negative, culorile vor apărea aproape una de cealaltă (adesea suprapuse), în timp ce în celulele canceroase semnalele se vor împărți ca urmare a rearanjării cromozomilor (Figura 4).
Figura 3: Reprezentant vedere al genei ALK translocație detectat de PEȘTE., Regiunile 5′ și 3 ‘ ale genei sunt vizualizate cu o fluorescență verde și respectiv roșie. A. nucleu de tip sălbatic. B. nucleul celulelor canceroase, care arată divizat sondele caracteristice. C. nucleul celulelor canceroase, care arată divizat sondele caracteristice. O a treia sondă poate fi utilizată pentru a defini rearanjarea cromozomilor care are loc efectiv.
O A treia sondă care vizează potențialul partener ALK ar putea confirma și defini în continuare rearanjarea cromozomilor care apare la un pacient (figura 4c)., Cancerele pulmonare care prezintă mutații care duc la hiperactivarea ALK pot fi tratate cu inhibitori ALK, cum ar fi Crizotinib. aceasta este cea mai frecventă malignitate la femei și a doua cauză principală de deces legat de cancer la nivel mondial. Cancerul de sân este adesea caracterizat prin anomalii ale stării receptorilor, ceea ce duce la o reglare a căilor de transducție celulară responsabile de proliferarea și supraviețuirea celulelor. În special, aproximativ 20-30% din tumorile de cancer de sân sunt cunoscute că supraexprimă HER2/Neu, membru al familiei EGFR., Un tratament comun în aceste cazuri este Trastuzumab, un anticorp monoclonal umanizat aprobat de FDA în 1998 pentru tratamentul cancerului de sân. Mecanismul său molecular exact rămâne de elucidat, dar acest anticorp probabil împiedică activarea HER2 prin legarea la domeniul său extracelular. În plus, se pare că induce liza celulelor tumorale care stimulează citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi (ADCC). FISH, folosind o sondă adecvată împotriva HER2, poate fi utilizat pentru a identifica copii suplimentare ale genei, un semn că este mai probabil să răspundă la tratamentul cu Trastuzumab.,
Figura 4: Reprezentant vedere al potențialului carcinom mamar celule. Semnalul HER2 este reprezentat în roșu; sonda centromere 17 (verde) poate fi utilizată pentru a enumera numărul cromozomului. A. HER2-carcinom mamar non-amplificat: două centromere 17 și două copii ale genei HER2 așa cum era de așteptat. B. HER2 – amplificat carcinom mamar de detectare multiplă pentru HER2. pestele pentru Cancerul vezicii urinare este a cincea cea mai frecventa malignitate umana si a doua cea mai frecvent diagnosticata tumora genitourinara dupa cancerul de prostata., Este o boală poligenă, ceea ce înseamnă că a fost asociată cu multiple anomalii genetice, cum ar fi mutațiile genelor FGFR3, RB1, HRAS, TP53 sau TSC1. Cu toate acestea, evenimentul de inițiere este probabil o mutație în regiunea 9p21, care conține gena p16/CDKN2A. În plus, celulele canceroase ale vezicii urinare se caracterizează printr-un grad ridicat de instabilitate cromozomială (CIN). Duplicarea sau segregarea cromozomilor disfuncționali în timpul mitozei determină rearanjări și translocări ADN, câștig sau pierdere de cromozomi întregi (aneuploidie) sau fragmente cromozomiale., Dezechilibrul rezultat al materialului genetic se înrăutățește după fiecare ciclu celular. Modelele genomice ulterioare pot fi legate de diferitele etape ale dezvoltării tumorii, formele mai invazive prezentând numărul mai mare de modificări citogenetice.
modificările cromozomiale numerice și structurale găsite în celulele cancerului vezicii urinare pot fi utilizate ca markeri tumorali.
în mod specific, detectarea simultană a variației numărului de copii a cromozomilor 3, 7 și 17 și ștergerea regiunii 9p21 (conținând p16) de către FISH folosind patru sonde distincte este o practică obișnuită., Această metodă este utilă pentru furnizarea de informații despre progresia cancerului si recurenta.
pește pentru leucemie limfocitară cronică (CLL)
analiza malignităților hematologice este unul dintre exemplele tipice ale avantajelor peștilor pentru analiza probelor caracterizate printr-un cariotip variabil și o activitate mitotică scăzută. LLC este cea mai frecventă leucemie la adulți. Nu a fost asociată cu o modificare genetică recurentă specifică., In schimb, similar cu cancerul vezicii urinare, un grup de mutații diferite a fost asociat cu diferite severități ale bolii și sunt utilizate ca indicatori predictivi ai cursului clinic al pacientului. Panourile de pește, în acest caz, includ adesea sonde pentru a detecta trisomia 12 și ștergerile 11Q, 13Q și 17p., Ștergerea 11q, care, în cele mai multe cazuri se referă la gena ATM, este găsit la pacienții care prezintă o progresie rapid de cancer; trisomia 12 este asociat cu stadii avansate ale bolii, rezistenta la chimioterapie și mai scurt timpul de supravietuire; ștergerea 13 q este cel mai frecvent întâlnit și este în general asociat cu un prognostic mai favorabil; deleția 17p de multe ori include o deleție a genei TP53 și corespunde stadiului avansat al tumorii, cu o slabă rată de supraviețuire.
Enzo Life Sciences este un lider global în tehnologiile de etichetare ADN și ARN., Oferim o gamă de produse pentru nevoile dvs. de cercetare în domeniul genomicii și cancerului. Pentru o simplă și eficientă metodă de generare a etichetat ADN-ul, vă rugăm să verificați noastre Nick traducere ADN labeling kit precum si o lista noastră SEEBRIGHT® colorant fluorescent-dUTPs și Alilamină-dUTP. Nu sunteți sigur dacă să utilizați biotină sau digoxigenină pentru etichetarea sondei ISH? Vă putem ajuta acolo! Nu uitați să verificați spectatorul lui Enzo pentru profilurile de excitație și emisie de lungimi de undă ale coloranților obișnuiți și ale celorlalte teste bazate pe celule fluorescente., În timp ce vă aflați la el, vă rugăm să consultați TechNote-ul nostru despre avantajele și dezavantajele peștilor, aCGH și NGS și cum să utilizați alilamină-dUTP pentru etichetarea sondei ADN de pește. Pentru toate întrebările și preocupările legate de oricare dintre produsele noastre, echipa noastră de asistență tehnică este aici pentru a vă ajuta.