Descoperirea SmacCas9
Pentru a modifica ancestrale 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM specificitatea SpyCas9, începutul și rapoarte recente au angajat regizat de evoluție (de exemplu, „VQR”, „EQR”, „VRER”, și „NRNH” variante) sau raționale de proiectare informat de către structura de cristal (de exemplu, „QQR”, „NG”, și „NR” variante)17,18,19,20,21,22. Aceste rapoarte s-au concentrat pe PAM-contactarea arginina reziduuri R1333 și R1335 care desființa funcția de când exclusiv mutante., În timp ce aceste studii au identificat mutații compensatorii care au dus la modificarea specificității PAM, variantele Cas9 pe care le-au produs au menținut o preferință guanină în cel puțin o poziție a secvenței PAM pentru editarea in vivo raportată. Concomitent rapoarte au folosit evolutiv informații pentru a vă relaxa în continuare canonice 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) PAM specificitate de Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) sau pentru a descoperi alternative 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) PAM specificitatea canonice 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) PAM de Neisseria meningitidis Cas923,24., Nucleazele din ambele rapoarte noi preferă totuși conținutul GC în cel puțin o poziție a secvenței PAM. Ne-am propus să ridicăm astfel de condiții preliminare pentru conținutul GC printr-un flux de lucru personalizat bazat pe bioinformatică, care exploatează diversitatea PAM existentă în Streptococcus genus25. Folosind această strategie, am folosit SmacCas9 ca având potențialul de a suporta modificat non-GC PAM specificitate la alinierea 115 orthologs de SpyCas9 din UniProt (limitat la cei cu mai mult de 70% perechi BLOSSOM62 scor)., Din alinierea am găsit SmacCas9 fost unul din cei doi aproape omologii, împreună cu un Streptococcus mutans B112SM-O Cas9 (SmutCas9), care posedă glutamines la ambele poziții aliniat la altfel foarte conservate PAM-contactarea arginines (Fig. 1A-b; suplimentar Fig. 2a). Reziduurile de arginină sunt cunoscute pentru a prefera puternic guaninele în peisajul interacțiunii aminoacid-bază, după cum reiese din specificitatea 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) a SpyCas9. Reziduurile de glutamină, pe de altă parte, se leagă preferențial de adenine, prin interacțiunea cu marginea principală a canelurei26., Astfel, am emis ipoteza că SmacCas9 a coevoluat în mod natural mutațiile compensatorii necesare pentru a obține o nouă recunoaștere Pam bogată în adenine. O dimensiune mică a eșantionului de 13 distanțiere din matricea CRISPR a genomului său corespunzător ne-a împiedicat să deducem cu încredere SmacCas9 PAM în silico., Cu toate acestea, posibilitatea de SmacCas9 necesită mai puțin GC-conținutul în PAM a fost susținută de secvență similitudini cu „QQR” varianta care are 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) specificity27, în plus față de CEL bogat prezumtiv consens PAM pentru phage-originare distanțiere în CRISPR matrice asociate cu extrem de omoloage SmutCas9, care au fost identificate cu ajutorul nostru anterior descrise SPAMALOT conducte și în concordanță cu previziunile anterioare (Fig. 1C; suplimentar Fig. 2b; suplimentar Fig. 3) 25,28.
o Secvență de aliniere a SpyCas9, sa QQR variantă, și SmacCas9. Pas în subliniind linia roșie marchează aderarea SpyCas9 și SmacCas9 pentru a construi o SpyMac hibrid. Secvența logo-ul (Weblogo instrument on-line) imediat sub aliniere descrie conservare la 11 poziții în jurul PAM-contactarea arginines de SpyCas9., B organizarea domeniului SpyCas9 juxtapus peste o structură codificată de culoare a spycas9 ghidată de ARN (PDB ID 5F9R). Cele două fire de ADN sunt negre, cu excepția unui segment magenta corespunzător PAM. O hartă de culoare albastru–verde-roșu este utilizată pentru etichetarea domeniului Cas9 PI și a secvenței distanțiere de ghidare pentru a evidenția structurile care conferă specificitatea secvenței și prevalența contactelor intra-domeniu în cadrul PI43. c-O secvență logo-ul generat on-line (WebLogo), care a fost de intrare cu prezumtiv PAM secvențe găsit în Streptococcus fagul și asociat cu aproape SmacCas9 omologii.,
Inginerie și PAM caracterizarea SpyMac
Am procedat pentru a determina empiric PAM preferințele de mai multe Streptococcus orthologs care se schimba una sau ambele critică PAM-contacte. Pe baza a demonstrat exemple de PAM-interacțiunea domeniu (PID) și ghidul de ARN (gRNA) având eco-compatibilitate între Cas9 orthologs care sunt strâns legate și activă, care am construit-o noi variante de rațional schimb PI regiune din punct de vedere catalitic „mort” SpyCas9 (dSpyCas9) cu cele ale selectat orthologs (Suplimentare Fig., 2A-B)29,30. Asamblate variante, inclusiv dSpyMacCas9 (denumit în continuare dSpyMac), s-au separat cotransformed în celule de E. coli, împreună cu ghidul de ARN derivate din S. pyogenes și un 8-mer PAM biblioteca de baze uniforme de reprezentare în PAM-SCANR genetice circuit, stabilite de Leenay et al.31. Circuitul upregulates o proteină fluorescentă verde (GFP) reporter proporțional cu puterea de legare PAM. Prin urmare, am colectat populațiile de celule GFP pozitive prin citometrie în flux (Fig suplimentar., 4) și Sanger le-a secvențiat în jurul site-ului PAM pentru a determina preferințele de bază în funcție de poziție în recunoașterea PAM a unei variante corespunzătoare. dSpyMac, mai mult decât dSpyMutCas9, a generat o urmă de profil, care a fost cel mai consecvent cu guanină-independent PAM recunoaștere, împreună cu o dominantă specificitate pentru adenină dinucleotides (Fig. 2a; suplimentar Fig. 2c).
un Cromatogramele reprezentând PAM-SCANR bazate pe îmbogățirea varianta-recunoașterea PAM secvențe din 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(^{\prime}\), biblioteca. B geluri de agaroză colorate cu SYBR care prezintă digestia in vitro a substraturilor 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) după 16 minute de incubare cu 100 nM de ansambluri enzimatice ribonucleoproteine purificate. Săgețile disting dungile produselor despicate de substratul necurat (banda superioară)., Parcelele matriciale rezumă calculele fracțiilor scindate, care au fost efectuate într-un script personalizat pentru procesarea imaginilor cu gel. Probele au fost efectuate în duplicate biologice independente (n = 2). c măsurători de timp ale scindării substratului ADN țintă pentru SmacCas9 și SpyMac. d ADN substrat clivaj reprezentate grafic ca o funcție de 0,25:1, 1:1 și 4:1 raporturi molare de ribonucleoprotein la țintă de tip sălbatic SpyCas9 și hibrid SpyMac. Datele sursă sunt furnizate ca fișier de date sursă.,
Apoi, ne-am purificat nuclează-enzime active pentru a continua cercetarea ADN-ul țintă recunoașterea potențialului și unicitatea SpyMac. (Fig Suplimentar. 5a)27,32. Vom individual incubate la ribonucleoprotein complex de enzime (compus din Cas9 + crRNA + tracrRNA) cu dublu catenar țintă substraturi de toate 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prim -}\)-vecine bază de combinații la un adenin dinucleotid PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); Fig. 2b)., O scurtă 16-min digestie indicat atât de tip sălbatic SmacCas9 și hibrid SpyMac despicat adiacente 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) motive în sens mai larg și uniform decât cele raportate anterior QQR varianta. SpyMac sa distins în continuare cu rate rapide de tăiere a ADN-ului care seamănă cu cinetica digerării rapide a SpyCas9 (Fig. 2c-d)33. Am fugit reacții care a folosit diferite crRNA distanțier lungimi și tracrRNA secvență, ca acesta din urmă diferă ușor între S. macacae și S. pyogenes genomuri (Suplimentare Fig. 5B-E)., Nici unul dintre acești doi parametri compensat mai lent clivaj rata de SmacCas9, dar am observat o îmbunătățire marginală în activitatea de tip sălbatic forma cu nativ tracrRNA, care se comportă cu interfața ghid-Cas9 interacțiune fiind în mare parte în afara de PI domeniu.
modificarea Genomului cu iSpyMac
un CRISPResso2 indel analiza următoarele NGS a amplificat regiuni genomice pentru a evalua pe-țintă prin iSpyMac în comparație cu SpyMac și SpyCas9, pe indicată 5\(^{\prime}\)-ANA-3\(^{\prime}\) și 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM secvențe. Probele au fost efectuate în două replici de transfecție independente (n = 2). B harta calorică a eficienței testului de toleranță la nepotrivire asupra țintelor genomice., Frecvențele indel cuantificate, evaluate prin algoritmul TIDE41, sunt expuse pentru fiecare nepotrivire unică sau dublă marcată în secvența Sgrna pentru varianta Cas9 indicată și secvența PAM indicată. Probele au fost efectuate în două replici de transfecție independente (n = 2). c CRISPResso2 genomice de bază de editare, analiză în urma ÎNTÂLNIRILOR de adn genomic pentru a evalua conversie de cytosines să thymines de iSpyMac-BE3. Probele au fost efectuate în două replici de transfecție independente (n = 2). Toate datele sursă sunt furnizate ca fișier de date sursă.,
Apoi, am evaluat toleranța de iSpyMac nepotrivite secvențe, prin angajarea sgRNAs adăpostirea dublu sau single nepotriviri de la un fix protospacer în AAVS gene, care posedă un 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\) PAM secvență. iSpyMac a demonstrat capacități de editare pe ținte cu nepotriviri unice în segmentul Pam-proximal al sgRNA., Pentru a atenua acest lucru ar trebui off-țintă predilecție, am introdus R691A mutație, care a fost anterior izolată prin bacteriene selecție pentru SpyCas9 pentru a menține ridicat pe-țintă de activitate în timp ce reducerea off-țintă editing35. Varianta noastră de înaltă fidelitate, HiFi-iSpyMac, a prezentat o activitate aproape neglijabilă pe secvențe nepotrivite, în comparație cu enzima originală, cu o pierdere minimă a activității la țintă (Fig. 3b).,
în cele din Urmă, am selectat o fereastră de patru nucleotide în VEGFA locus într-o secvență de context, astfel că orice alte CRISPR endonucleaze cu consumul raportat de bază de editare nu ar permite lor de bază de editare cu un al citidin-topit enzyme36. În consecință, ne-am cotransfected HEK293T celule cu un nickase formă de iSpyMac derivate din raportate anterior BE3 arhitectura pentru citozină de bază de editare (iSpyMac-BE3) și sgRNA plasmidă vizează un PAM aval de selectat nucleotides5., Am măsurat nivelurile eficiente de editare a bazei în celulele recoltate, care au prezentat o conversie de peste 20% a citozinei în timină în aceste poziții prin analiza NGS (Fig. 3c).