Acest material este însoțit de o prezentare a structurii și principiilor proteinei din spatele probelor de denaturare și a electroforezei discontinue în gel.separarea macromoleculelor într-un câmp electric se numește electroforeză. O metodă foarte comună pentru separarea proteinelor prin electroforeză utilizează un gel discontinuu de poliacrilamidă ca mediu suport și dodecil sulfat de sodiu (SDS) pentru a denatura proteinele. Metoda se numește electroforeză în gel de dodecil sulfat de sodiu poliacrilamidă (SDS-PAGE)., Sistemul cel mai frecvent utilizat este, de asemenea, numit Laemmli metoda după BRITANIE Laemmli, care a fost primul care a publicat o lucrare care utilizează SDS-PAGE într-un studiu științific. SDS (numit și lauril sulfat) este un detergent anionic, ceea ce înseamnă că, atunci când este dizolvat, moleculele sale au o sarcină negativă netă într-un interval larg de pH. Un lanț polipeptidic leagă cantități de SDS proporțional cu masa moleculară relativă. Sarcinile negative asupra SDS distrug cea mai mare parte a structurii complexe a proteinelor și sunt puternic atrase spre un anod (electrod încărcat pozitiv) într-un câmp electric., gelurile de poliacrilamidă împiedică moleculele mai mari să migreze la fel de repede ca moleculele mai mici. Deoarece raportul încărcare-masă este aproape același între polipeptidele denaturate SDS, separarea finală a proteinelor depinde aproape în întregime de diferențele de masă moleculară relativă a polipeptidelor. Într-un gel de densitate uniformă, distanța relativă de migrare a unei proteine (Rf, f ca indice) este proporțională negativ cu jurnalul masei sale., Dacă proteinele de masă cunoscute sunt rulate simultan cu necunoscutele, relația dintre Rf și masă poate fi reprezentată grafic, iar masele de proteine necunoscute estimate. separarea proteinelor prin SDS-PAGE poate fi utilizată pentru a estima masa moleculară relativă, pentru a determina abundența relativă a proteinelor majore într-o probă și pentru a determina distribuția proteinelor între fracții. Puritatea probelor de proteine poate fi evaluată și progresul unei proceduri de fracționare sau purificare poate fi urmat., Diferite metode de colorare pot fi folosite pentru a detecta proteine rare și pentru a afla ceva despre proprietățile lor biochimice. Tehnicile specializate, cum ar fi Western blotting, electroforeza bidimensională și cartografierea peptidelor, pot fi utilizate pentru a detecta produsele genetice extrem de rare, pentru a găsi asemănări între ele și pentru a detecta și separa izoenzimele proteinelor.
masa moleculară versus greutatea moleculară
masa moleculară (simbolul m) este exprimată în Daltoni (Da). Un Dalton este definit ca 1/12 masa de carbon 12., Majoritatea macromoleculelor sunt suficient de mari pentru a utiliza kilodaltonul (kDa) pentru a descrie masa moleculară. Greutatea moleculară nu este aceeași cu masa moleculară. Este, de asemenea, cunoscut sub numele de masă moleculară relativă (simbol Mr, unde r este un indice). Greutatea moleculară este definită ca raportul dintre masa unei macromolecule și 1/12 masa unui atom de carbon 12. Este o cantitate fără dimensiuni.când literatura dă o masă în Da sau kDa se referă la masa moleculară. Este incorect să se exprime greutatea moleculară (Masa moleculară relativă) în Daltoni., Cu toate acestea, veți găsi termenul greutate moleculară utilizat cu Daltoni sau kilodaltoni în unele literaturi, adesea folosind abrevierea MW pentru greutatea moleculară. gelurile de poliacrilamidă pentru SDS-PAGE au fost dezvoltate multe sisteme pentru electroforeza proteinelor, iar aparatele utilizate pentru SDS-PAGE variază foarte mult. Metodologia utilizată în aceste pagini utilizează metoda Laemmli. Referirea la metoda Laemmli într-o secțiune materiale și metode elimină necesitatea de a descrie tampoanele, turnarea gelurilor, aparatelor etc., Dacă hârtia are unele modificări la metoda, singura detalii de SDS-PAGE, care ar trebui să fie raportate în secțiunea metode sunt procente total acrilamidă (%T) într-un gel, procentul și tipul de reticulant (%C), și, probabil, o referință la gel dimensiuni. Folosim un sistem „mini-gel”, cu casete de gel 3 1/4″ x 4″. SDS-PAGE poate fi realizat pe geluri pre-turnate, economisind problemele și pericolul de a lucra cu acrilamidă. Următoarea descriere se aplică aparatelor de turnare și de rulare fabricate în magazin, care sunt mult mai ieftine decât echipamentele disponibile în comerț., În plus față de eficiența costurilor, un avantaj de a face propriile geluri pentru prima dată este o înțelegere mai profundă a procesului. indiferent de sistem, prepararea necesită turnarea a două straturi diferite de acrilamidă între plăcile de sticlă. Stratul inferior (separarea sau rezolvarea gelului) este responsabil pentru separarea efectivă a polipeptidelor după mărime. Stratul superior (gel de stivuire) include puțurile de probă. Acesta este conceput pentru a Matura proteine într-o probă între două limite în mișcare, astfel încât acestea sunt comprimate (stivuite) în straturi subțiri micrometru atunci când ajung la gelul de separare.,