Frontiere în Științe Veterinare

Introducere

Nevertebrate numără aproximativ un milion de specii de animale ținute atât în zoologice instituții și în gospodării în care acestea sunt crescute ca animale de companie exotice (1). Gastropodele cuprind aproape 60.000 de specii de moluște acvatice și terestre, în special melci și melci (1). Melcul uriaș African (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) este originară din Africa de Est, cu toate acestea este o specie invazivă răspândită în Asia, Oceania și, mai recent, în America, unde a fost introdusă accidental sau intenționat ca sursă de hrană și ca animal de companie. Eliberarea sa în ecosistemele naturale, zonele agricole și urbane a dus la amenințări ecologice, de sănătate și agricole (2, 3). Gigantul terenurilor din Africa de melc este o gazdă intermediară pentru mai multe paraziți, inclusiv Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp.,, și Fasciola hepatica (4, 5). Toate helminții de mai sus, cu excepția lui A. abstrusus, pot provoca boli grave la om. Mai exact, melcul uriaș African este principalul gastropod responsabil pentru răspândirea la nivel mondial a A. cantonensis care provoacă meningoencefalita eozinofilă umană în Asia și America (2, 6). Factorii de risc pentru infecția la om, animale de companie și animale sălbatice cu acești paraziți helminți includ ingestia de melci sau melci infectați brute sau insuficient, sau alimente contaminate de șuvoiul de melci sau melci infectați (4, 5, 7, 8).,deși melcii africani giganți sunt printre cei mai populari melci ținuți ca animale de companie, iar popularitatea lor la nivel mondial ca animale de companie exotice crește rapid, doar câteva sondaje au fost efectuate cu privire la apariția paraziților lor în condiții naturale (2, 6, 9-11). Scopul acestui sondaj a fost de a investiga apariția paraziților în melcii de pământ Africani uriași crescuți ca animale de companie în sudul Italiei.,

Materiale și Metode

Date Generale

În August 2018, trei bazine de probe de fecale proaspete, obținute dintr-un total de 60 gigant African melci teren, păstrate în diferite colecții private situate în Pozzuoli, Caserta și Napoli (Italia), au fost investigate pentru paraziți. Din fiecare localitate am obținut un bazin de fecale de la 20 de melci individuali fiecare. Melcii incluși în acest studiu au avut o vârstă mediană de 1, 6 ani, cuprinsă între 0, 2 și 2 ani și nu au primit niciun tratament antiparazitar anterior., Melcii au fost hraniti cu legume și fructe proaspete; în plus, un calciu pulbere suplimente (Calciu, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Germania) a fost furnizat de două ori pe săptămână. Toate animalele au fost crescute în Italia, în proprietate privată și ținute ca animale de companie în patru terarii interioare de dimensiuni de 60 × 30 × 45 cm, în grupuri de 10-20 de animale (2 grupe de 20 de melci în Pozzuoli și Caserta și 2 grupe de 10 melci fiecare în Napoli)., Un sol organic de turbă (sol organic de Coco-turbă, produse E-Coco, Gloucestershire, Marea Britanie), tratat anterior termic (100°C timp de 30 min) și apoi lipsit de paraziți și insecte, a fost folosit ca substrat.

proceduri de diagnosticare

douăzeci de grame de fecale proaspete au fost inițial obținute din fiecare dintre cele patru terariu., Când reunite fecale analizate prin frotiu proaspăt, flotație și Baermann test a aratat pozitivitate la rhabditid nematozi, doi melci de fiecare pozitive terariu au fost adăpostite individual într-un mediu steril cutie de plastic, și fecalele lor au fost colectate, imediat după defecare, într-un mediu steril 50 ml tub de plastic. Examinarea coprologică pentru probele grupate și individuale a inclus frotiu proaspăt, flotație centrifugă (2 g de fecale pentru fiecare test) folosind o soluție de zahăr și formaldehidă (greutate specifică 1,27) și testul Baermann (10 g de fecale pentru fiecare test)., În plus, mucusul obținut în timpul examinării frotiului proaspăt a fost analizat sub un microscop luminos. Deoarece formele larvare de mai multe specii de helminți pot encyst interiorul piciorului mușchi de melci, examinarea histologică a biopsiei probele recoltate de la partea anterioară și posterioară zone ale piciorului mușchi a fost efectuat în 30 de melci, anesteziat cu tehnica descrisă de Giannelli et al. (12) și Gilbertson și Wyatt (13)., Probele de biopsie au fost fixate în formalină neutră tamponată cu fosfat 10% și prelucrate prin metode de rutină în blocuri de parafină care au fost tăiate în secțiuni groase de 3 µm și colorate cu hematoxilină și eozină. Studiul a fost realizat cu permisiunea practicii în care a avut loc și cu acordul semnat, scris, informat al proprietarului.

identificarea morfologică

monturile temporare au fost realizate prin nematode termo-ucigătoare pe lamele de sticlă într-o picătură de apă, după care s-a aplicat o alunecare a capacului de sticlă., Nematodele au fost transferate într-o picătură de apă de la robinet pe o lamelă de sticlă și plasate pe încălzitor (100°C) timp de 10 s. aceste specimene au fost utilizate pentru identificarea morfologică. O AMPLIVAL microscop optic Carl Zeiss Jena, și o Leitz Diaplan cu Nomarski optice au fost utilizate pentru observare., Identificarea morfologică a rhabditid nematozi urmat Andrassy (14) și Andrassy (15) și s-a bazat în mare parte pe morfologia faringe și anus contra naturii, și a sistemului de reproducere, în principal caracteristicile de spicules, numărul și poziția de papile sau prezența și mărimea sau forma de bursa pentru bărbați; și coada de formă, de poziție ale vulvei și morfologia aparatului genital la femele. Identificarea larvelor s-a bazat pe forma cozii.

analiza moleculară

ADN-ul a fost extras din specimene de nematode obținute din fecale fixate în etanol 96% colectat din cele trei localități., Nematodele au fost spălate în apă dublu distilată (ddH2O) peste noapte, înainte de analiza moleculară, pentru îndepărtarea completă a reziduurilor de etanol. Fiecare nematod individual a fost transferat într-un tub steril Eppendorf (200 µl) cu 20 µl de tampon de extracție (17,7 µl de ddH2O, 2 µl de 10 × tampon PCR concentrat, 0,2 µl de 1% Tween 20 și 0,1 µl de proteinază K). Tamponul și nematodele au fost congelate la -20°C timp de 20 min, apoi incubate imediat la 65°C timp de 1 oră, urmate de 10 min la 95°C., Lizatele au fost răcite pe gheață și apoi centrifugate (2 min, 9,000 g); 1 µl de supernatant a fost utilizat pentru PCR.un fragment de ADNR care conține regiunile distanțiere transcrise interne (ITS1, 5.8 s, ITS2) a fost amplificat folosind grunduri 18S: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (înainte) și 28S: 5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′ (invers) (16). Un fragment de ADNR care conține gena pentru ARNr 18S a fost amplificat folosind primerii 22F: 5′- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3′ (înainte) și 1080jr: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3′ (invers) (17). Amestecul PCR master a constat din: ddH2O, 7.,25µl; 10 × PCR buffer, 1.25 µl; dezoxinucleozid trifosfați (dNTPs), 1 µl; 0.75 µl de ambele înainte și înapoi grund; – polimerazei, de 0,1 µl, 1 µl de ADN-ul extras. Profilele PCR au fost utilizate după cum urmează: pentru ciclul său 1 de 94°C timp de 7 minute urmat de 35 de cicluri de 94°C timp de 60 s, 50°C timp de 60 s și 72°C timp de 60 s și o alungire finală la 72°C timp de 7 min (14); pentru ciclul 18S 1 de 94°C timp de 5 minute, urmat de 35 de cicluri de 94°C timp de 60 s, 55°C timp de 90 s și 72°C timp de 2 C timp de 10 min., Produsele PCR au fost secvențiate de GATC Biotech (Germania) și ulterior editate și încărcate în GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

rezultate

testul Baermann a evidențiat prezența larvelor de nematode, a căror lungime a variat între 170 și 336 µm, în toate probele. Ouăle, larvele și nematodele rabditide adulte au fost detectate prin metode proaspete de frotiu și flotație în toate probele fecale. Rhabditella axei (Figura 1) a fost identificată morfologic din două din cele trei probe combinate și individuale de fecale din Pozzuoli și Napoli. În plus, Rhabditis terricola, Cruznema sp.,, și Pristionchus entomophagus au fost izolate dintr-o piscină și probe fecale individuale din Caserta. Nu au fost detectați paraziți în probele de biopsie musculară sau în mucus.

Mai multe tipuri morfologice de nematode rabditide au fost izolate din fecalele melcului fixate în etanol 96%. Secvențele obținute și editate ale ITS și 18S ale acestor nematode au fost comparate (BLAST) cu materialul din GenBank și identificate ca R. axei (partial 18S, accession number MK124578, similarity 99%), Rh., terricola (parțială 18S și parțială ITS1, aderarea numărul MK156052, similitudine 100%), P. entomophagus (parțială 18S și parțială ITS1, aderarea numărul MK156050, similitudine 99%) și Cruznema sp. (parțial 18S și parțial ITS1, numărul de acces MK156051, similitudine 96-100%).rezultatele acestui studiu indică faptul că toți melcii de pământ africani giganți examinați depun ouă, larve și nematode rabditide adulte în fecale și, prin urmare, pot reprezenta o sursă de infecție pentru alte animale de companie și oameni. Pentru a evita identificarea greșită cu Strongyloides sp., o specii de nematode arată asemănare strânsă cu rhabditids care are o clară parazitare zoonotici relevanța (14, 15, 18), inițial morfologice diagnosticul de rhabditid nematozi a fost confirmat prin analize moleculare.Rhabditidae includ nematode saprofite cu viață liberă, care se găsesc pe scară largă în sol și resturi organice, unde se hrănesc în principal cu bacterii. Multe specii de melci pot servi ca gazde finale definitive pentru nematodele rabditide (14, 15). Cu toate acestea, un număr de specii de Rabdită și Rabditella a fost asociat cu vertebrate, inclusiv oameni (14, 15, 19-27)., Deși prezența lor poate fi rezultatul contaminării mediului, aceste nematode pot provoca boli la multe animale și oameni. Rhabditis elongata, Rh. homini și Rh. larvele usuii au fost izolate din fecale umane, urină și tampoane vaginale (19-21). Cu toate acestea, nu au fost raportate multe cazuri de infecții simptomatice la om (21-24). Feng și Li (25) au descris două cazuri umane de infecție urinară de către R. axei în China și Ahn și colab. (20) au fost raportate cinci cazuri umane de infecție intestinală cu Rabdită sp. la copiii școlari din mediul rural din Coreea de Sud., În mod similar, două cazuri de infectie intestinala om de R. axel au fost descrise în China (26), în timp ce o altă lucrare publicată (21) a raportat un caz de infecții intestinale în a 5-luni-vechi copil Brazilian care a fost prezentat cu febră și apos și diaree cu sânge; coprological de examinare a relevat ouă, larve și adulți de Rhabditis sp. Meamar și colab. (27) a descris apariția diareei apoase la doi pacienți Iranieni cu SIDA, asociate cu infecții intestinale severe de larve și specimene adulte de R. axei. În cele din urmă, Teschner și colab., (24) a descris recent un caz de infecție a canalului urechii externe la un bărbat de 37 de ani prezentat cu otoree purulentă din ambele urechi și pierderea acută a auzului cauzată de Rabdita sp. În general, Rhabditis spp. sunt considerate o cauza frecventa a otitei externe la bovine care trăiesc în zonele tropicale (de exemplu, America de sud și Africa), în special la animalele mai mari, și au fost identificate, de asemenea, la găini, câini și porci cu incoercible diaree (18, 28-30). Cu toate acestea, au fost descrise și infecții asimptomatice, iar aceste nematode sunt adesea considerate pseudoparazite (28, 29).,deși nematodele cu viață liberă au fost recuperate în toate probele fecale, nu s-au găsit specimene în mucus și probe histologice. O posibilă explicație pentru această constatare este că nematodele se pot localiza în diferite țesuturi/organe ale gazdei lor, în funcție de tipul de asociere nematod/gazdă de moluște (15, 31, 32). Rhabditis spp. finalizați ciclul său de viață în interiorul melcului, fără a afecta gazda moluștelor sale. Studii anterioare privind melcii Africani liberi (Archachatina spp. și Achatina spp.) a arătat că R., axa trăiește în tractul gastro-intestinal al gazdei sale de melc, unde întregul ciclu de viață al nematodelor este finalizat (31-33).

Deși Africane melci gigant sunt listate ca gazde pentru R. axel, apariția acestui nematod au fost raportate doar în câteva specii de gigant African melci, alții decât A. fulica, și anume Archachatina marginata ovulului, Ar. marginata saturalis și Achatina achatina (31). Pe de altă parte, P. entomophagus are o distribuție la nivel mondial și a fost asociat în principal cu gândacii de bălegar aparținând superfamiliei Scarabaeoidea (34, 35), R., terricola a fost găsită în salamandre (14, 15) și Cruznema spp. în cricket Gryllodes laplatae (Orthoptera) (36). În toate cazurile, transmiterea parazitului are loc prin contactul melcilor cu solul umed contaminat, bogat în descompunerea materiei organice (31, 37). Deși, în prezent, toate animalele au fost ținute în terarii cu un sol organic tratat termic, speculăm că infecția s-ar fi putut produce înainte de achiziționarea animalelor la magazinele de animale de companie sau la unitățile de reproducere.,în concluzie, rezultatele noastre indică faptul că melcii de pământ African gigant pot servi ca rezervor al mai multor nematode rabditide. Această specie de melci este printre cele mai frecvent păstrate ca animale de companie și, prin urmare, trăiesc adesea în imediata apropiere a oamenilor. Ca urmare, este posibilă contaminarea mediului intern prin fecalele lor. Deși nematodele parazitare nu au fost izolate în acest studiu, melcii uriași Africani ar trebui să fie considerați în continuare potențiali purtători de nematode capabili să provoace boli oportuniste la om., Prin urmare, vom evidenția importanța continuare cercetări epidemiologice privind apariția gratuit-living si nematodele parazitare în gasteropod melci ținute în captivitate, și subliniază necesitatea măsurilor de control strict pentru a reduce riscul de infecții oportuniste cu rhabditid nematozi în melc de companie proprietari.

contribuțiile autorului

Dd ‘ o și MS au conceput și planificat analiza. MS și JN au efectuat analiza. CA a ajutat la modelarea cercetării și a editat manuscrisul. Toți autorii au oferit feedback critic și au contribuit la manuscrisul final.,

Declarație privind conflictul de interese

autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

PubMed Abstract | Google Scholar