electroforeza în Gel definiție
electroforeza în Gel este o procedură utilizată pentru separarea moleculelor biologice după mărime. Separarea acestor molecule se realizează prin plasarea lor într-un gel cu pori mici și crearea unui câmp electric peste gel. Moleculele se vor mișca mai repede sau mai lent în funcție de mărimea lor și de sarcina electrică., procesul de electroforeză în gel funcționează deoarece moleculele încărcate negativ se îndepărtează de polul negativ al curentului electric, iar moleculele mai mici se vor mișca mai repede decât moleculele mai mari. Astfel, se realizează o separare a mărimii în bazinul de molecule care trec prin gel. Gelul funcționează într-un mod similar cu o sită care separă particulele după mărime. Electroforeza funcționează pentru a muta particulele, folosind sarcina lor electrică inerentă, prin sită.,
când cercetătorii încearcă să distingă între diferite segmente de ADN, de exemplu, procesul este simplu. Probele sunt încărcate în canale la începutul gelului. Fiecare moleculă de ADN are aceeași încărcătură (-1), deoarece ADN-ul este format din aceleași 4 nucleotide și poartă întotdeauna o sarcină ușor negativă, indiferent de dimensiunea sa. Prin urmare, fiecare moleculă de ADN va avea aceeași forță trăgând-o prin gel.cu toate acestea, dimensiunea fiecărei molecule împiedică progresul acesteia prin gel., Moleculele mari lovesc părți ale matricei de gel și sunt încetinite. Moleculele de ADN mici pot aluneca între diferitele componente ale matricei de gel și se pot deplasa rapid spre cealaltă parte a gelului. După o anumită perioadă de timp, moleculele de ADN vopsite pot fi văzute agregând în diferite zone ale gelului, în funcție de cât de departe s-au mutat în timpul electroforezei în gel. Acest lucru permite cercetătorilor să identifice segmentele și să compare ADN-ul diferitelor organisme.
pentru ce se utilizează Electroforele Gel?,scopul electroforezei în gel este de a vizualiza, identifica și distinge moleculele care au fost prelucrate printr-o metodă anterioară, cum ar fi PCR, digestia enzimatică sau o condiție experimentală. Adesea, amestecurile de acizi nucleici sau proteine care sunt colectate dintr-un experiment/metodă anterioară sunt conduse prin electroforeză în gel pentru a determina identitatea sau a diferenția între molecule.,
prin Electroforeză în Gel de Pași
În mare, pașii de urmat într-o comună de ADN prin electroforeză în gel de protocol:
Pregătirea probelor pentru rularea
ADN-ul este izolat și preprocesate (de exemplu, PCR, digestia enzimatică) și a făcut în soluție de bază de colorant albastru pentru a vizualiza mișcarea de probă prin gel.
se prepară o soluție de gel de agaroză tae
tamponul TAE oferă o sursă de ioni pentru configurarea câmpului electric în timpul electroforezei., Concentrația greutate-volum de agaroză în tamponul TAE este utilizată pentru prepararea soluției. De exemplu, dacă este necesar un gel de agaroză 1%, se adaugă 1 g de agaroză la 100 ml de TAE. Procentul de agaroză utilizat este determinat de cât de mare sau mic este de așteptat să fie ADN-ul. Dacă unul se uită la separarea de o piscină de dimensiuni mai mici ADN benzi (<500bp), un procent mai mare, gel de agaroză (>1%) este pregătit. Procentul mai mare de agaroză creează o sită mai densă pentru a crește separarea diferențelor mici de lungime a ADN-ului., Soluția de agaroză-TAE este încălzită pentru a dizolva agaroza.soluția de agaroză TAE este turnată într-o tavă de turnare care, odată ce soluția de gel s-a răcit și s-a solidificat, creează o placă de gel cu un rând de puțuri în partea de sus.
setarea camerei de electroforeză
gelul solid este plasat într-o cameră umplută cu tampon TAE. Gelul este poziționat astfel încât puțurile camerei să fie cele mai apropiate de electrodul negativ al camerei.,
încărcarea gelului
godeurile camerei de gel sunt încărcate cu probele de ADN și, de obicei, o scară ADN este de asemenea încărcată ca referință pentru dimensiuni.
electroforeza
cablurile negative și pozitive sunt conectate la cameră și la o sursă de alimentare unde este setată tensiunea. Pornirea sursei de alimentare stabilește câmpul electric și probele de ADN încărcate negativ vor începe să migreze prin gel și departe de electrodul negativ spre pozitiv.,
oprirea electroforezei și vizualizarea ADN-ului
odată ce colorantul albastru din probele de ADN a migrat prin gel suficient de departe, sursa de alimentare este oprită și gelul este îndepărtat și plasat într-o soluție de bromură de etidiu. Bromura de etidiu intercalează între ADN și este vizibilă în lumina UV. Uneori, bromura de etidiu se adaugă direct la soluția de gel de agaroză în pasul 2. Gelul colorat cu bromură de etidiu este apoi expus la lumină UV și se face o fotografie. Benzile ADN sunt vizualizate din fiecare bandă corespunzătoare unui puț de cameră., Scara ADN care a fost încărcată este, de asemenea, vizualizată și lungimea benzilor ADN poate fi estimată. Un exemplu este dat în figura de mai jos.
Tipuri de Electroforeză în Gel
Există două tipuri de electroforeză în gel: limbă nativă și denaturare. Electroforeza cu gel nativ încearcă, de obicei, să păstreze ARN-ul sau proteina în structura sa nativă în timp ce o rulează prin gel., Denaturarea electroforezei în gel încearcă să reducă ARN-ul sau proteina în structura sa cea mai liniară înainte sau în timpul electroforezei în gel.denaturarea ARN-ului sau a proteinei se realizează prin adăugarea unui agent reducător la probă, gel și/sau tampon. Agentul reducător separă legăturile din molecula ARN sau proteină și reduce astfel structura sa secundară. Structura secundară a unei proteine sau ARN va influența, într-o manieră neliniară, cât de repede migrează printr-un gel., Cu toate acestea, o formă liniară denaturată de ARN sau proteină va migra proporțional cu dimensiunea sa liniară (perechi de baze sau daltoni kilo). Electroforeza în gel de denaturare este adesea mai precisă pentru identificarea mărimii, în timp ce electroforeza în gel nativă este de obicei utilizată pentru a identifica complexe proteice mai mari.
Exemple de electroforeză în Gel
- Tae agaroză electroforeza în Gel este cel mai frecvent utilizat pentru ADN.
- TBE și pagina de denaturare (electroforeza în gel de poliacrilamidă) sunt comune pentru separarea ARN.,
- SDS PAGE este o electroforeză în gel de denaturare utilizată în mod obișnuit pentru identificarea și separarea proteinelor.