Ce este electroforeza în gel de poliacrilamidă (pagina)?

tehnici Electroforetice separa molecule încărcate într-un câmp electric. Mobilitatea unei molecule este invers proporțională cu dimensiunea sa și direct proporțională cu sarcina sa. În timpul electroforezei, proteinele se deplasează spre un electrod încărcat opus într-un câmp electric.,viteza mișcării lor într-un Sistem electroforetic este guvernată de mai mulți factori, cum ar fi temperatura, pH-ul și concentrația tampon, în plus față de proprietățile intrinseci, cum ar fi dimensiunea, sarcina și forma proteinelor.separarea electroforetică a proteinelor strict pe baza greutății lor moleculare este posibilă numai dacă încărcarea tuturor moleculelor de proteine poate fi manipulată la același semn. Într-un astfel de caz, mobilitatea moleculelor de proteine va depinde exclusiv de dimensiunea lor.,electroforeza în gel de poliacrilamidă (PAGE) este o tehnică bazată pe această idee și este utilizată pentru a separa proteinele pe baza mărimii lor.

principiile paginii

în pagină, un detergent anionic numit dodecil sulfat de sodiu (SDS) este utilizat pentru a se lega de proteine și a le da o sarcină negativă. Proteinele sunt apoi separate electroforetic în funcție de mărimea lor folosind o matrice de gel din poliacrilamidă într-un câmp electric.poliacrilamida este produsă ca urmare a reacției de polimerizare dintre acrilamidă și n,N’-metilen-bis-acrilamidă (BIS) folosind un catalizator., Gradul de polimerizare sau reticulare poate fi controlat prin ajustarea concentrației de acrilamidă și BIS.

cu cât este mai reticulată cu atât gelul este mai greu. Duritatea gelului, la rândul său, modulează frecarea experimentată de macromolecule atunci când călătoresc prin gel în timpul paginii, afectând astfel rezoluția de separare.gelurile libere (4-8% acrilamidă) permit moleculelor cu greutate moleculară mai mare să migreze mai repede prin gel, în timp ce gelurile dure (12-20% acrilamidă) restricționează migrarea moleculelor mari și permit selectiv celor mici să se deplaseze prin gel.,

SDS-Page protocol

1. Pregătirea probei:

probele de proteine sunt denaturate prin încălzirea lor cu un detergent SDS și mercaptoetanol. Primul se leagă puternic de proteine și le dă o sarcină negativă ridicată, în timp ce acesta din urmă eliberează grupări sulfhidril, rezultând astfel lanțuri polipeptidice care poartă o sarcină negativă în exces și o sarcină similară în raport cu masa. Acest lucru ajută la rezolvarea proteinelor strict pe baza dimensiunii lor în timpul electroforezei în gel.

2., Prepararea gelului:

gelul electroforetic are de obicei mai multe componente, inclusiv acrilamidă, BIS și un tampon. Amestecul este degazat pentru a preveni formarea bulelor în timpul polimerizării gelului. Persulfat de amoniu, o sursă de radicali liberi și un stabilizator sunt adăugate pentru a începe polimerizarea. BIS este, de asemenea, adăugat pentru a forma legături încrucișate între moleculele de acrilamidă până când se formează în cele din urmă un gel.

3. Electroforeza:

ca un curent electric este aplicat proteinele migrează prin gel la electrodul pozitiv, deoarece acestea au o sarcină negativă., Fiecare moleculă se mișcă la o rată diferită în funcție de greutatea sa moleculară – moleculele mici se mișcă mai rapid prin gel decât cele mai mari. Migrația este de obicei mai rapidă la tensiuni mai mari. După câteva ore, moleculele de proteine sunt separate prin dimensiune.

4. Colorare și de vizualizare:

Odată ce electroforeză este completă, gel pot fi colorate folosind vopsele colorate, cum ar fi Coomassie Brilliant Blue sau bromură de etidiu pentru a face separat de proteine, apar ca distincte benzi colorate pe gel.colorantul nelegat este spălat din gel., Gelurile colorate sunt apoi uscate, astfel încât intensitatea culorii benzilor proteice poate fi măsurată. Benzile de proteine radioactive pot fi detectate prin autoradiografie. Proteinele pot fi, de asemenea, cuantificate, deoarece conținutul de proteine este direct proporțional cu cantitatea de colorant legat.unele sisteme de gel introduc un colorant de urmărire, cum ar fi bromofenol albastru, împreună cu proba de proteine – distanța vizibilă parcursă de colorant pe gel ajută la stabilirea duratei necesare de electroforeză., Bromofenolul albastru călătorește împreună cu moleculele de probă până când ajunge în cele din urmă la fundul gelului. Electroforeza trebuie să se oprească în acest moment pentru a se asigura că moleculele de proteine nu electroforează din gel și în tampon.

bibliografie

• Toate Electroforeză Conținut
• Electroforeză ca un Instrument în Criminalistica
• Tipuri de Electroforeză Capilară

citări