O Preto a Morte de 1347-1351, causada pela bactéria Yersinia pestis2,3, fornece um dos melhores exemplos históricos de uma emergente infecção, com a rápida disseminação e alta mortalidade, alegando uma estimativa de 30% a 50% da população Europeia em apenas cinco anos period4. Discrepâncias nas tendências epidemiológicas entre a doença medieval e as infecções modernas da Y. pestis desencadearam controvérsia sobre o Agent etiológico da pandemia 5,6., Embora investigações antigas de DNA tenham fortemente implicado Y. pestis2, 3 na pandemia antiga, as alterações genéticas na bactéria podem ser parcialmente responsáveis por diferenças na manifestação e gravidade da doença. Para compreender a evolução do organismo é necessário caracterizar as mudanças genéticas envolvidas em sua transformação de um patógeno sylvático para um capaz de infecção humana pandêmica na escala da Peste Negra, e determinar a sua relação com estirpes atualmente circulantes., Aqui começamos esta discussão apresentando a primeira sequência de rascunhos do genoma do patógeno antigo.
Y. pestis é um descendente recentemente evoluído do bacillus Yersinia pseudotuberculosis7, que no decurso da sua evolução adquiriu dois plasmídeos adicionais (pMT1 e pPCP1) que lhe fornecem mecanismos especializados para infiltrar hospedeiros de mamíferos. Para investigar potenciais mudanças evolutivas em um desses plasmídeos, relatamos a triagem de 46 dentes e 53 ossos da coleção East Smithfield de Londres, Inglaterra, para a presença do Y., ppcp1 específico da pestis (ref. 3). Dados históricos indicam que o cemitério de East Smithfield foi estabelecido no final de 1348 ou início de 1349 especificamente para o enterro de vítimas da Morte Negra (figos 1 e 2 suplementares), tornando a coleção bem adequada para investigações genéticas da antiga Y. pestis. Os dados da sequência de ADN para cinco dentes obtidos através da captura molecular do Ppcp1 específico de Y. pestis revelou um padrão de danos C A T característico do antigo dna9 endógeno autêntico, e a montagem do conjunto Illumina reads permitiu a reconstrução de 98,68% dos 9.,Plasmídeo de 6 quilobase com um mínimo de duas coberturas3.
para avaliar a adequação dos métodos de captura para a reconstrução do genoma antigo completo, vários extratos de DNA de ambas as raízes e coroas decorrentes de quatro dos cinco dentes que renderam a mais alta cobertura ppcp13 foram usados para enriquecimento array-based (Agilent) e subsequente sequenciação de alto rendimento na plataforma Illumina GAII10. A remoção de moléculas duplicadas e subsequente filtragem produziu um total de 2 366 647 leituras cromossómicas de alta qualidade (Tabela complementar 1a, b) com um comprimento médio de fragmento de 55.,53 pares de bases (Fig. suplementar. 4), que é típico para o DNA antigo. As estimativas de cobertura produziram uma média de 28,2 leituras por local para o cromossoma, e 35,2 e 31,2 para os plasmídeos pCD1 e pMT1, respectivamente (Fig. Quadro 1-A, c, d e Quadro 1-B, c). A cobertura era previsivelmente baixa para a pPCP1 (Fig. 1e) porque sondas específicas a este plasmídeo não foram incluídas nos arrays. Cobertura correlacionada com o conteúdo GC (figura suplementar. 6), uma tendência anteriormente observada para dados de sequência de alta capacidade11., A cobertura em cada metade do cromossomo foi desigual devido a diferenças na profundidade de sequenciamento entre as duas matrizes, com leitura média de 36,46 e 22,41 por local para matriz 1 e matriz 2, respectivamente. Embora uma maior profundidade tenha contribuído para uma maior média de leituras por site, não aumentou a cobertura geral, com ambas as matrizes cobrindo 93,48% das regiões visadas com um mínimo de cobertura onefold (quadro suplementar 1b)., Isto indica que o nosso procedimento de captura recuperou com sucesso moléculas modelo de todas as regiões genômicas acessíveis através deste método, e que sequenciamento mais profundo não resultaria em dados adicionais para as regiões template CO92 não cobertas em nosso conjunto de dados.
a, c–e, de Cobertura de parcelas para o cromossoma (a) e os plasmídeos pMT1 (c), pCD1 (d) e pPCP (e). Cobertura em azul, conteúdo GC em verde., Linhas de escala indicam 10-, 20-, 30-, 40- e 50 vezes a cobertura e 10%, 20%, 30%, 40% e 50% de conteúdo GC. Para plasmídeos, vermelho corresponde a regiões de codificação, amarelo a elementos móveis. O cromossoma mostra uma cobertura mediana por gene. Os plasmídeos mostram cada local desenhado. As distribuições de cobertura para os plasmídeos são apresentadas na figura suplementar. 5. b, distribuições mostram a cobertura cromossômica do array 1 (Azul) e array 2 (vermelho), indicando que sequenciamento mais profundo aumenta o número de leituras por local, mas não influencia substancialmente a cobertura geral.,
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a arquitectura do genoma é conhecida por variar amplamente entre os estreitos existentes da Y. pestis12. Para extrapolar a ordem dos genes no nosso genoma antigo, analisámos o mapeamento da referência CO92 para todos os extractos provenientes de um único indivíduo que apresentou a maior cobertura (indivíduo 8291). Apesar do comprimento de Leitura curta das nossas sequências antigas e da natureza altamente repetitiva do genoma da Y. pestis, foram extraídos 2.221 contigs correspondentes à CO92, compreendendo um total de 4.367.867 bp., Para identificar potenciais regiões do genoma antigo que são arquitetonicamente distintas de CO92, todas as leituras que não mapeiam a referência CO92 foram, por sua vez, consideradas para a construção contig. Após filtragem para um comprimento mínimo de 500 bp, 2,134 contigs permaneceram compreendendo 4,013,009 bp, dos quais 30,959 derivaram de leituras não mapeadas. A pesquisa de explosão convencional pesquisou contra o genoma CO92 fósforos identificados para 2.105 contigs. As provas de uma arquitectura alterada foram identificadas em 10 contigs (quadro complementar 2). Um exemplo de tal variante estrutural é mostrado na Fig., 2, onde a montagem guiada por referência incorporando leitura não mapeada para abranger o ponto de paragem valida sua reconstrução. Este genético específico orientação é encontrado apenas em Y. pseudotuberculosis e Y. pestis cepas Mictrotus 91001, Angola, Pestoides F e B42003004, que são ancestrais de todas as Y. pestis é comumente associada com infecções humanas (ramo 1 e seção 2 strains13,14). Além disso, discrepâncias no arranjo desta região nos ramos 1 e 2 estirpes modernas de Y. pestis indicam que os rearranjos ocorreram como eventos separados em diferentes linhagens.,
leituras mapeadas nas posições a (azul) e B (verde) são 231 kb separados no genoma CO92 linearizado. A sequência adjacente é de alta cobertura, embora apenas 18× e 20× é mostrado devido a restrições de espaço (Preto) Para A E B, respectivamente. A variante estrutural foi montada usando leituras que não mapearam para CO92 (vermelho)., Sua posição é mostrada no cromossomo Microtus 91001 linearizado, onde o 9.096 bp contig mapeia com 100% de identidade.
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Single-nucleotide diferenças entre a nossa antiga genoma e o CO92 de referência, surpreendentemente, consistia de apenas 97 cromossômicas posições, e 2 e 4 posições no pCD1 e pMT1 plasmídeos, respectivamente (Complementar Tabela 3), indicando apertado genética de conservação em que este organismo nos últimos 660 anos. Vinte e sete dessas posições não foram relatadas em uma análise anterior de Y existente., pestis diversidade14 (quadros complementares 3 e 4). A comparação do nosso genoma antigo com o seu ancestral Y. pseudotuberculosis revelou que a sequência medieval continha o nucleótido ancestral para todas as 97 posições, indicando que não possui quaisquer posições derivadas ausentes em outras estirpes de Y. pestis. Dois diferences cromossomais previamente relatados3 não estavam presentes em nossos dados de seqüência genômica, sugerindo que eles provavelmente derivaram de citosinas desaminadas que teriam sido removidas na presente investigação através do tratamento uracilo-DNA-glicosilase antes da captura de array.,
Para colocar a nossa antiga genoma de uma filogenética contexto, caracterizado todas as 1,694 previamente identificados filogeneticamente informativos positions14 (Complementar Tabela 4), e comparados com aqueles das nossas antigas organismo contra a agregação da base de dados de chamada para 17 publicamente disponíveis Y. pestis genomas e os ancestrais Y. pseudotuberculosis. Quando consideradas separadamente, sequências de três das quatro vítimas caem apenas duas substituições da raiz de todas as estirpes de Y. pestis humanas existentes (Fig. 3a), e mostram uma relação mais próxima com o ramo 1 Y., pestis than to branch 2; however, one of the four victims (individual 6330) was infected with a strain that contained three additional derived positions seen in all other branch 1 genomes14. Isso sugere a presença de múltiplas estirpes na pandemia de 1348-1350 em Londres ou mudanças de microevolução que ocorrem em uma única estirpe, que é conhecida por ocorrer em surtos de doença 15. Apoio adicional para Y., a microevolução pestis é indicada pela presença de várias posições variantes para as quais os dados de sequência de um indivíduo mostram dois nucleótidos diferentes a frequências comparáveis (tabela suplementar 5). A posição 2896636, por exemplo, é uma posição polimórfica conhecida nas populações de Y. pestis existentes, e esta posição mostra o estado derivado fixo em um indivíduo (6330) e o estado polimórfico em outro (individual 8291) em cobertura mínima de cinco vezes (figura suplementar. 7). Isto fornece um exemplo notável de microevolução capturada durante uma pandemia histórica., As restantes posições de variância permanecem inalteradas nos 18 genomas Yersinia existentes, portanto, podem ser únicas para o organismo antigo e são, portanto, de maior interesse. A amostragem adicional de genomas antigos irá ajudar a determinar a frequência destas mutações nas estirpes Co-circulantes de Y. pestis, e irá clarificar o aparecimento de estirpes do ramo 2 que ainda não foram reportadas em amostras antigas.
a, Median network of ancient and modern Y. pestis based on 1.694 variant positions in modern genomes14. Os círculos coloridos representam clados diferentes, tal como definidos na ref. 13. Círculos cinzentos representam nós hipotéticos. b, Phylogenetic tree using 1.694 variable positions. Os intervalos de tempo de divergência são mostrados em anos civis, com suporte de bootstrap (azul itálico) e probabilidade posterior Bayesiana (azul). A caixa cinzenta indica estirpes patogénicas conhecidas., A, NZ ACNQ01000; Nepal516, NC 008149; KIM10, NC 004088; B, NZ AAYT01000; C, NZ ABAT01000; D, NZ ACNS01000; E, NZ AAYS01000; F, NZ AAOS02000; CO92, NC 003143; G, NZ ABCD01000; H, NZ AAYV01000; I, NC 014029; J, NZ AAYR01000; Antiqua, NC 008150. c, Geographical origin of genome sequences used in a and b. d, Geographical spread of the Black Death from infection routes reported in ref. 4.,
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Consistente topologias de árvore foram produzidos utilizando-se vários métodos de construção e todas as principais nós foram suportados pelo probabilidade posterior (pp) valores de >0.96 e bootstrap valores >90 (Fig. 3b e figos suplementares 8 e 9). As árvores colocam a sequência East Smithfield perto do nó ancestral de todas as estirpes de Y. pestis humanas existentes (apenas duas diferenças em 1.694 posições) e na base do ramo 1 (Fig. 3b)., Uma data segura para o sítio de East Smithfield de 1348-1350 permitiu-nos atribuir uma calibração da ponta à sequência antiga e, assim, datar o tempo de divergência dos genomas modernos e do genoma East Smithfield usando uma abordagem Bayesiana. Estimativas temporais indicam que toda a Y., pestis comumente associada com a infecção humana, compartilharam um ancestral comum em algum momento entre 668 e 729 anos atrás (ad 1282-1343, 95% mais alta densidade de probabilidade, HPD), abrangendo um número muito menor intervalo de tempo que recentemente publicado estimates14 e mais, indicando que todos os que circulam atualmente ramo 1 e seção 2 isola surgiram durante o século xiii, no mínimo (Fig. 3b), potencialmente proveniente de uma fonte da Ásia Oriental, como foi sugerido anteriormente 14., Isto implica que a peste medieval foi o principal evento histórico que introduziu as populações humanas ao ancestral de todas as estirpes patogénicas conhecidas de Y. pestis. Isto questiona ainda a etiologia da peste Justiniana do século VI a VIII, popularmente assumida como resultado do mesmo patógeno: nossas estimativas temporais implicam que a pandemia foi causada por uma variante da Y. pestis que é distinta de todas as estirpes atualmente circulantes comumente associadas a infecções humanas, ou era outra doença completamente diferente.
embora a nossa abordagem de usar um Y existente., pestis modelo de referência para isca de design excluída a nossa capacidade para identificar regiões genômicas que pode ter sido presente no antigo organismo e foram, posteriormente, perdeu em CO92, genômica comparações de nossos antigos sequência contra a sua próxima outgroups pode produzir insights valiosos para Y. pestis evolução. A estirpe Microtus 91001 é o ramo 1 e o ramo 2 mais próximos, confirmados como não patogénicos para o ser humano16, pelo que as alterações genéticas podem representar contribuições para a adaptação do patogéneo a um hospedeiro humano., Comparações com este grupo externo revelaram 113 mudanças (tabela suplementar 6a, b), muitas das quais são encontradas em genes que afetam funções associadas à virulência como formação de biofilm (hmsT), aquisição de ferro (iucD) ou adaptação ao ambiente intracelular (phoP). Da mesma forma, embora o seu potencial de virulência em seres humanos ainda não tenha sido confirmado ao nosso conhecimento, Y. pestis B42003004 isolada de uma população chinesa de marmotas17 foi identificada como a estirpe mais próxima do nó ancestral de toda a Y., pestis comumente associada com a peste humana, e, portanto, pode fornecer informações fundamentais sobre a evolução do organismo. A comparação completa do genoma com a sequência de East Smithfield revelou apenas oito diferenças de um único nucleótido (tabela suplementar 6c), seis das quais resultam em alterações não sinónimas (tabela suplementar 6d). Embora estas diferenças provavelmente não afetem a virulência, a influência da perda genética, ganho genético ou rearranjos genéticos,todos os quais estão bem documentados em Y. pestis12, 18, é ainda indeterminada., Em termos evolutivos mais recentes, diferenças de um nucleótido em vários genes associados a patogenia conhecidos foram encontrados entre o nosso genoma antigo e a sequência de referência CO92 (tabela suplementar 3), que pode representar adaptações adicionais para hospedeiros humanos.,através do enriquecimento por captura de ADN, juntamente com a sequenciação de ADN de alto rendimento, reconstruímos um projecto de genoma para o que é, sem dúvida, o patogénico humano mais devastador da história, e revelámos que a praga medieval do século XIV foi provavelmente responsável pela sua introdução e distribuição generalizada nas populações humanas. Isso indica que o patógeno implicado na Peste Negra tem parentes próximos no século XXI que são endêmicos e emergentes 19., Introdução de novos patógenos para populações são normalmente associados com aumento da incidência e da gravidade das disease20 e, embora os mecanismos que regem esse fenômeno são complex21, dados genéticos a partir de antigas doenças infecciosas vai prestar inestimável contribuição para a nossa compreensão do hospedeiro–patógeno evolução conjunta. A Peste Negra é um exemplo seminal de uma infecção emergente, viajando pela Europa e ceifando a vida de cerca de 30 milhões de pessoas em apenas 5 anos,o que é muito mais rápido do que as taxas contemporâneas de infecção pela peste bubónica ou pneumónica 22 e disseminação7, 8., Independentemente, embora não existentes Y. pestis tensão possui o mesmo perfil genético como o nosso antigo organismo, os nossos dados sugerem que, com poucas alterações nos conhecido virulência associados genes têm acumulados no organismo 660 anos de evolução como um patógeno humano, mais o que sugere que sua percepção de maior virulência em history23 não pode ser devido a novela ponto fixo mutações detectáveis através da abordagem analítica descrita aqui., No nosso atual resolução, podemos supor que alterações moleculares de patógenos, mas são um componente de uma constelação de fatores que contribuem para a mudança de doenças infecciosas prevalência e a gravidade, onde a genética do hospedeiro population24, climate25, vetor dynamics26, social conditions27 e interações sinérgicas com concorrentes diseases28 deve ser acima de tudo nas discussões da população susceptibilidade a doenças infecciosas e hospedeiro–patógeno relações com referência a Y. pestis infecções.