a Descoberta de SmacCas9
Para modificar o ancestral 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM especificidade de SpyCas9, início e relatórios recentes têm utilizado de uma evolução dirigida (por exemplo, “VQR”, “QEQ”, “VRER”, e “NRNH” variantes) ou racional design informado pela estrutura cristalina (por exemplo, “QQR”, “NG” e “NR” variantes)17,18,19,20,21,22. Estes relatórios centravam-se nos resíduos de arginina em contacto com PAM R1333 e R1335 que abolem a função quando exclusivamente mutados., Embora esses estudos tenham identificado mutações compensatórias que resultaram na alteração da especificidade PAM, as variantes Cas9 que produziram mantiveram uma preferência de guanina em pelo menos uma posição da sequência PAM para a edição in vivo. Simultâneas relatórios de ter usado evolutiva informações adicionais relaxar canônico 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) PAM especificidade de Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) ou para descobrir alternativa 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) PAM especificidade canônico 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) PAM Neisseria meningitidis Cas923,24., Os nucleases de ambos os novos relatórios, no entanto, ainda preferem o conteúdo GC em pelo menos uma posição da sequência PAM. Pretendemos levantar tais pré-requisitos de conteúdo GC através de um fluxo de trabalho personalizado de Bioinformática que mina a diversidade PAM existente no Streptococcus genus25. Usando esta estratégia, estamos hospedados no SmacCas9 como tendo o potencial para suportar alterada não-GC PAM especificidade sobre o alinhamento 115 ortólogos’de SpyCas9 do UniProt (limitado a, aqueles com mais de 70% de vitórias em pares BLOSSOM62 pontuação)., A partir do alinhamento encontramos SmacCas9 foi uma das duas fechar homologs, juntamente com um Streptococcus mutans B112SM-UM Cas9 (SmutCas9), munido de glutaminas em ambas as posições alinhadas de modo altamente conservadas PAM contato arginines (Fig. 1a-b; Supplementary Fig. 2A). Os resíduos de arginina são conhecidos por preferir fortemente guaninas na paisagem de interacção aminoácido-base, como evidenciado pela especificidade de 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) de SpyCas9. Os resíduos de glutamina, por outro lado, ligam-se preferencialmente às adeninas, através da interacção com o principal groove edge26., Nós, portanto, hipotetizamos que SmacCas9 tinha naturalmente coevolvido as mutações compensatórias necessárias para ganhar o novo reconhecimento PAM rico em adenina. Uma pequena amostra de 13 espaçadores da matriz CRISPR de seu genoma correspondente impediu-nos de inferir confiantemente o SmacCas9 PAM in silico., No entanto, a possibilidade de SmacCas9 exigindo menos GC-conteúdo em seu PAM foi apoiado pela sequência de semelhanças com o “QQR” variante que tem 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) specificity27, além da rica suposto consenso PAM para o fago-originários espaçadores em CRISPR matrizes associadas altamente homólogos SmutCas9, que foram identificados com o auxílio de nossos anteriormente descrito SPAMALOT pipeline e consistente com as anteriores previsões (Fig. 1C; Suplemento Fig. 2B; Figo suplementar. 3) 25,28.
um alinhamento de sequência de SpyCas9, sua variante QQR, e SmacCas9. O passo na linha vermelha saliente marca a junção de SpyCas9 e SmacCas9 para construir um híbrido SpyMac. O logotipo da sequência (Weblogo online tool) imediatamente abaixo do alinhamento mostra a conservação em 11 posições em torno das argininas PAM-contactando de SpyCas9., b the domain organization of SpyCas9 justaposed over a color-coded structure of RNA-guided, target-bound SpyCas9 (PDB ID 5F9R). As duas cadeias de ADN são pretas, com excepção de um segmento magenta correspondente ao PAM. Um mapa de cores azul-verde-vermelho é usado para rotular o domínio Cas9 PI e sequência de espaçadores de guia para destacar estruturas que conferem especificidade de sequência e a prevalência de contatos intra-domínio dentro do PI43. c a sequence logo generated online (WebLogo) that was input with putative PAM sequences found in Streptococcus phage and associated with close SmacCas9 homologs.,
Engenharia e caracterização PAM de SpyMac
procedemos a determinar empiricamente as preferências PAM de vários Ortólogos de Streptococcus que alteram um ou ambos os críticos contactos PAM. Baseado em exemplos demonstrados do domínio PAM-interaction (PID) e RNA-guia (gRNA) com compatibilidade cruzada entre ortólogos Cas9 que estão intimamente relacionados e ativos, nós construímos novas variantes através da troca racional da região PI de spycas9 cataliticamente “morto” (dSpyCas9) com os das ortologias selecionadas (Fig suplementar., 2A-B) 29,30. Montado variantes, incluindo dSpyMacCas9 (aqui referido como dSpyMac), foram separadamente cotransformed em E. coli células, juntamente com a guia de RNA derivado de S. pyogenes e um 8-mer biblioteca PAM de uma base uniforme de representação no PAM-SCANR genética circuito, criado por Leenay et al.31. O circuito eleva-se a um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) em proporção à força de ligação à PAM. Portanto, coletamos as populações de células GFP positivas por citometria de fluxo (Figo suplementar., 4) e Sanger sequenciou – os em torno do local do PAM para determinar as preferências de base em posição em uma variante correspondente do reconhecimento PAM. dSpyMac, mais do que dSpyMutCas9, gerou um perfil de traço que foi mais consistente com o reconhecimento PAM independente da guanina, juntamente com uma especificidade dominante para dinucleótidos de adenina (Fig. 2a; Suplemento Fig. 2C).
um Cromatogramas representando o PAM-SCANR enriquecimento a partir da variante-reconhecer PAM sequências a partir de 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(^{\prime}\) biblioteca. b SYBR manchada de gel de agarose mostrando digestão in vitro de 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) substratos após 16 minutos de incubação com 100 nM de purificada ribonucleoprotein enzima assembléias. As setas distinguem a bandagem dos produtos clivados do substrato não folheado (banda superior)., Os gráficos de matriz resumem os cálculos de fração clived, que foram realizados em um script personalizado para o processamento de imagens de gel. As amostras foram realizadas em duplicados biológicos independentes (n = 2). c medições do curso Temporal da clivagem do substrato de ADN-alvo para o SmacCas9 e o SpyMac. d a clivagem do substrato de ADN plotada em função das razões molar de 0,25:1, 1:1 e 4:1 da ribonucleoproteína para o alvo para SpyCas9 de tipo selvagem e spymac híbrido. Os dados de fonte são fornecidos como um arquivo de dados de fonte.,
a seguir, purificámos as enzimas activas da nuclease para continuar a sondar o potencial de reconhecimento do ADN-alvo e a singularidade do SpyMac. (Suplementar Fig. 5A) 27,32. Nós, individualmente, incubadas a ribonucleoprotein complexo de enzimas (composto de Cas9 + crRNA + tracrRNA) com double-stranded alvo substratos de todos os 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prime}\)-vizinha da base de dados de combinações de uma adenina dinucleotídeo PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); Fig. 2b)., Uma breve digestão de 16 minutos indicava tanto o SmacCas9 de tipo selvagem como o SpyMac híbrido clivado adjacente a 5\(^{\prime}\)-naan-3\(^{\prime}\) motivos mais amplos e uniformemente do que a variante QQR anteriormente comunicada. SpyMac distinguiu-se ainda mais com rápidas taxas de corte de DNA que se assemelham à cinética de digestão rápida de SpyCas9 (Fig. 2C-d)33. Nós corremos reações que usaram diferentes comprimentos de espaçador crRNA e sequência tracrRNA, como a última difere ligeiramente entre os genomas de S. macacae E S. pyogenes (Figo suplementar. 5B–E)., Nenhum destes dois parâmetros compensou a menor taxa de clivagem do SmacCas9, mas notamos uma melhoria marginal na atividade da forma de tipo selvagem com seu tracrrrna nativo, que comporta com a interface da interação guide-Cas9 sendo principalmente fora do domínio PI.
edição do genoma com iSpyMac
um CRISPResso2 indel análise seguinte NGS do amplificadas regiões genômicas para avaliar-alvo edição de iSpyMac em comparação a SpyMac e SpyCas9, o indicado 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\) e 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM sequências. As amostras foram realizadas em dois replicados de transfecção independentes (n = 2). B Efficiency heatmap of mismatch tolerance assay on genomic targets., Frequências indel quantificadas, como avaliado pelo algoritmo TIDE 41, são exibidas para cada desfasamento rotulado único ou duplo na sequência sgRNA para a variante Cas9 indicada e sequência PAM indicada. As amostras foram realizadas em dois replicados de transfecção independentes (n = 2). c CRISPResso2 genomic base editing analysis following NGS of genomic amplicons to assess conversion of cytosines to thymines by iSpyMac-BE3. As amostras foram realizadas em dois replicados de transfecção independentes (n = 2). Todos os dados de fonte são fornecidos como um arquivo de dados de fonte.,
em seguida, avaliou-se a tolerância de iSpyMac a falta de correspondência de sequências, empregando sgRNAs abrigar duplo ou individual inadequação a uma fixo protospacer dentro dos AAVS gene, munido de um 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\) PAM sequência. iSpyMac demonstrou capacidades de edição em alvos com um único desfasamento dentro do segmento PAM-proximal do sgRNA., Para mitigar esta suposta propensão fora do alvo, introduzimos a mutação R691A, que foi anteriormente isolada através da seleção bacteriana para SpyCas9 para manter alta atividade no alvo, reduzindo a edição fora do alvo 35. A nossa variante de alta fidelidade, o HiFi-iSpyMac, exibiu uma actividade quase negligenciável em sequências incompatíveis, em comparação com a enzima original, com uma perda mínima de actividade no alvo (Fig. 3b).,
Por último, seleccionámos uma janela de quatro nucleótidos no locus VEGFA num contexto de sequência tal que qualquer outra endonuclease CRISPR com uso relatado para edição de base não permitiria a sua edição de base com um enzime36 de citidina. Assim, nós coptransfectamos células HEK293T com uma forma nickase de iSpyMac derivado da arquitetura BE3 anteriormente relatada para edição de base de citosina (iSpyMac-BE3) e o plasmídeo sgRNA visando um PAM a jusante dos nucleótidos selecionados 5., Medimos níveis efetivos de edição de base em células colhidas, que exibiram mais de 20% de citosina para conversão de timina nestas posições através da análise NGS (Fig. 3c).