o Diagnóstico Etiológico das Infecções Pneumocócicas
Pneumococos são uma das principais causas de pneumonia e uma importante causa de meningite, bacteremia, sepse, otite, rinite e sinusite . Classicamente, o diagnóstico etiológico destas infecções tem sido feito através do crescimento do microorganismo a partir de amostras de pacientes adequadas.,a identificação de Streptococcus pneumoniae a partir da cultura depende da observação das características morfológicas das bactérias e das Colónias, bem como de três outras características fenotípicas principais, incluindo a negatividade da catalase, a solubilidade biliar e a susceptibilidade à optocina. A susceptibilidade à optocina é um suporte para a identificação de pneumococos devido à facilidade de realização do teste, cuja base é a inibição da ATPase pneumocócica pela optoceína, uma característica que não é geralmente partilhada por outros estreptococos viridianos ., No entanto, o aparecimento de variantes resistentes à optocina pôs em causa a validade da utilização deste único teste para a identificação presumível de pneumococos. A especificidade do teste de solubilidade biliar permanece elevada e é o teste único mais preciso para a identificação de S. pneumoniae . O fenótipo da solubilidade biliar é devido à ativação da principal enzima autolítica (uma n-acetilmuramil-L-alanina amidase codificada pelo gene lytA), que também pode ser alcançada pelo deoxicolato de sódio., Alguns isolados pneumocócicos foram considerados insolúveis em deoxicolato de sódio, o que foi atribuído a alterações nas principais autolisinas , mas a esmagadora maioria do pneumococos permanecem solúveis na bílis, tornando-se um teste extremamente preciso para a identificação pneumocócica.a ionização por laser assistida por matriz-tempo de ionização por espectrometria de massa de voo (MALDI–TOF) está a trazer uma mudança fundamental na identificação de rotina de agentes patogénicos microbianos nos laboratórios de Microbiologia Clínica ., Apesar do sucesso da MALDI-TOF em agilizar e fornecer uma identificação consistentemente precisa, mesmo com organismos anteriormente problemáticos, o sucesso dos sistemas atualmente disponíveis na identificação de S. pneumoniae tem sido pobre . O perfil de massa dos sistemas MALDI-TOF implantados em laboratórios de Microbiologia Clínica é gerado principalmente por proteínas ribossómicas que facilitam o alinhamento com as classificações taxonómicas actuais. No Entanto, S., pneumoniae é um clado dentro do grupo de mitis evolutivamente relacionado com estreptococos, com o qual pode compartilhar muitas características, incluindo proteínas ribossômicas similares . Portanto, a distinção por MALDI-TOF entre S. pneumoniae e seus parentes menos patogênicos do grupo de mitis é difícil. Recentemente, argumentou-se que esta distinção poderia ser possível utilizando uma análise mais detalhada dos perfis de massa , e esta foi seguida por uma publicação que relata o sucesso de um sistema comercialmente disponível na distinção de S. pneumoniae de outras espécies do grupo mitis ., Estes desenvolvimentos encorajadores podem resultar na simplificação da identificação de rotina de S. pneumoniae em laboratórios de Microbiologia Clínica.
A capacidade de produzir um polissacárido capsular (CPS) é também uma marca de pneumococos. A cápsula pode ser visualizada por várias técnicas de microscopia, mas em pneumococos a presença de um SPC é geralmente detectada usando soros específicos . O Statens Serum Institut, em Copenhague, Dinamarca, é a fonte mais frequente de sera para identificar cápsulas pneumocócicas., Eles fornecem um “omni-soro” que reage com todas as cápsulas pneumocócicas conhecidas e que pode ser útil na identificação de pneumococos, bem como soros específicos que reagem apenas com polissacáridos particulares ou grupos de polissacáridos . Os pneumococos não encapsulados são conhecidos e têm sido frequentemente associados a surtos de conjuntivite . No entanto, uma vez que a produção de um SPC é uma característica definidora de pneumococos, estes foram submetidos a testes particularmente rigorosos para confirmar a sua identificação como S. pneumoniae .,
a identificação do SPC pneumocócico pelo efeito Quellung ou teste de Neufeld, utilizando soros de coelho específicos, é uma técnica comprovada que tem sido utilizada desde os primeiros dias de serotipagem pneumocócica . No entanto, esta técnica requer especialização específica, pelo que, mais recentemente, o Statens Serum Institut disponibilizou um teste de aglutinação em látex, o que permite um procedimento mais simplificado para a serotipagem de pneumococos . Para simplificar ainda mais este processo, foram desenvolvidos vários esquemas de “serotipagem genética” para identificar características particulares dos loci cps., Apesar da multiplicidade de abordagens, as mais amplamente adotadas baseiam-se na amplificação PCR de genes específicos de serogroup ou serótipo . De facto, foram desenvolvidos procedimentos de PCR convencionais e em tempo real, tendo sido proposta uma grande diversidade de esquemas para acomodar as diferenças na prevalência dos vários serótipos em diferentes regiões geográficas ., Embora a serotipagem genética tenha disponibilizado a serotipagem a um maior número de laboratórios e tenha ajudado a esclarecer reações pouco claras, os métodos fenotípicos continuam a ser o padrão-ouro para a serotipagem pneumocócica , e refletindo isso, abordagens híbridas envolvendo tanto PCR e anticorpos monoclonais também foram desenvolvidos ., Talvez os exemplos mais claros disso são isolados em que capsular locus contém mutações de ponto ou inserções levando à ausência de expressão de um CPS (van der Linden e Ramirez, dados não publicados), mas que seria atribuído um subtipo de acordo com a genética serotyping esquemas.metodologias mais recentes baseadas na detecção de componentes microbianos estão se tornando cada vez mais importantes no diagnóstico de infecções pneumocócicas ., O immunochromatographic detecção de C polissacarídeo (teichoic) ácido na urina tem melhorado muito o diagnóstico de pneumonia pneumocócica em adultos, embora em crianças a alta freqüência de pneumocócica transporte resultados inadequada especificidade do teste . O teste também é validado para uso no LCR, levando a um diagnóstico etiológico melhorado de meningite ., Há cada vez mais evidências da utilidade do teste na detecção de pneumococos em fluido pleural tanto em crianças quanto em adultos , mas há muito menos informações sobre o seu uso em lavagem broncoalveolar , em aspirados nasofaríngeos , ou em meios de cultura sanguínea, onde pode ser útil na detecção de pneumococos que já não são viáveis.mais recentemente, a detecção de ADN pneumocócico foi utilizada para diagnóstico. Para este efeito, foi utilizada a amplificação por PCR de fragmentos de genes específicos de S. pneumoniae, tais como lytA, ply, psaA, cpsA (wzg), ou spn9802., As metodologias de PCR em tempo Real demonstraram ser mais sensíveis do que a PCR convencional, mas outras variações, incluindo a detecção de produtos de PCR com esferas, microarrays ou fraccionamento de tamanho também foram desenvolvidas . A combinação da amplificação do ADN para identificação com as abordagens de serotipagem genética acima discutidas permite a identificação do serótipo da estirpe sem a necessidade de cultura . O uso dessas metodologias em efusões parapneumônicas ou empiema é bem documentado e aumenta grandemente o rendimento do diagnóstico etiológico sobre a cultura .,
Existe um grande interesse em utilizar estas metodologias para detectar pneumococos no sangue em casos de pneumonia em crianças e adultos . No entanto, a elevada taxa de transporte de pneumococos em crianças pode ser um factor importante na detecção da circulação de ADN pneumocócico em portadores saudáveis . Dois estudos abordaram especificamente esta questão, com resultados contraditórios . Outros estudos indicam que a carga pneumocócica estimada no sangue está correlacionada com a gravidade da doença e pode potencialmente ser usado para distinguir entre colonização e infecção .,
uma abordagem semelhante tem sido defendida no caso de espécimes respiratórios que estão mais frequentemente disponíveis, como o sputum. O valor do sputum no diagnóstico da pneumonia tem sido amplamente discutido , mesmo no contexto dos métodos de cultura convencionais. Embora se possa argumentar que a ausência de pneumococos poderia potencialmente excluí-la como um agente etiológico, uma hipótese que certamente justifica estudos adicionais, sua detecção pode ser atribuída a infecção ou transporte assintomático ., Em adultos, a quantificação do DNA pneumocócico ou pneumocócico no sputum foi proposta para distinguir entre colonização e doença , mas isso pode ser complicado pela variabilidade dos testes e pela falta de critérios claros para definir valores de corte, mesmo em amostras de boa qualidade . Em crianças, abordagens semelhantes têm sido sugeridas, mas o valor de diagnóstico desta abordagem é ainda questionado pelo fato de que muitas crianças são colonizadas por pneumococos em densidades muito altas., A monitorização de dois marcadores principais do hospedeiro, a proteína C-reactiva e a procalcitonina, parece aumentar a especificidade dos ensaios de PCR no diagnóstico de infecção pneumocócica do tracto respiratório inferior . Apesar destas incertezas, vários ensaios comercialmente disponíveis já oferecem a detecção de ADN pneumocócico para fins de diagnóstico .,embora os métodos microbiológicos tradicionais, incluindo os mais recentes métodos de detecção de antigénios, continuem a ser o principal suporte em muitos laboratórios para o diagnóstico de infecções pneumocócicas, novos métodos moleculares irão, sem dúvida, tornar-se cada vez mais importantes. O aumento da adopção de testes moleculares dependerá da clarificação da relevância para a identificação da infecção da detecção de provas da presença de produtos bacterianos em amostras humanas. Isto será particularmente complicado para os espécimes respiratórios, onde o debate continua em curso, mesmo para as abordagens mais tradicionais., Dada a nossa crescente compreensão das relações entre múltiplos patógenos no trato respiratório superior que podem condicionar a sua capacidade de causar infecções, abordagens moleculares que detectam múltiplos patógenos irão, sem dúvida, tornar-se cada vez mais importantes no diagnóstico etiológico de infecções do trato respiratório .