A Identificação de Elementos É em E. coli
É a elementos foram inicialmente detectados pelos efeitos causados se esses elementos estão integrados no lac (Malamy, 1966, 1970) e gal operons (Saedler e Starlinger, 1967a,b; Jordan et al., 1967; Adhya and Shapiro, 1969) of E. coli and into the early rightward operon of its bacteriophage lambda (Brachet et al., 1970)., Os elementos causam uma mutação nula do gene em que se integram e um efeito polar muito forte em todos os genes do operão localizado distalmente ao gene mutante. As mutações revertem espontaneamente para o tipo selvagem, mas a frequência de reversão não podia ser aumentada por mutagénicos. Isto levantou a suspeita de que as mutações não eram mutações pontuais, mas rearranjos de DNA.,pode demonstrar-se que a mutação adicionou ADN ao operão gal comparando a densidade do bacteriófago lambda dgal transdutor que transportava ou não a mutação e que era isogénico de outra forma (Jordan et al., 1968; Shapiro, 1969). Isto excluiu a possibilidade de que as mutações foram causadas por uma inversão do ADN. A fim de distinguir entre as duas possibilidades restantes, duplicação de parte da operação gal ou inserção neste operão de DNA não relacionado, Michaelis et al., (1969) compared the mutated and the nonmutated DNA by hybridizing RNA transcribed from the mutant to either DNA. Estes experimentos mostraram claramente que o DNA extra encontrado nos mutantes não foi derivado do operão gal. Além disso, pode ser demonstrado que o ADN extra em dois mutantes independentes partilhavam pelo menos algumas destas sequências. Isto levantou a possibilidade de que os mutantes não foram causados pela inserção de segmentos aleatórios de DNA de E. coli, mas sim pela transposição de elementos transponíveis específicos.,esta hipótese demonstrou ser verdadeira, quando um maior número de mutantes foi investigado inserindo moléculas de ADN heteroduplexo no microscópio electrónico (Fiandt et al., 1972; Hirsch et al.,1972a, b; Malamy et al., 1972). Nessa altura, poderiam ser identificados quatro elementos diferentes. Eles foram chamados de sequências de inserção (IS) e numerados consecutivamente IS1 até IS4. IS1 tem aproximadamente 0,8 Kb (quilobases) de comprimento. O outro é que os elementos têm um comprimento de cerca de 1,5 Kb. Um quinto elemento, IS5, de tamanho similar (Blattner et al.,, 1974) e um elemento maior de pouco mais de 5 Kb, que por razões históricas é chamado γ-δ(Guyer, 1978), foram detectados desde então, mas o número parece estar perto de saturação para E. coli K12.
dentro da limitação do microscópio eletrônico, os diferentes elementos não compartilham sequências, enquanto diferentes isolados do mesmo elemento são idênticos. Naturalmente, isto não exclui pequenas diferenças de sequência entre estas últimas.,
hibridação de cadeias únicas de ADN apropriadas partilhando apenas o elemento IS em forma complementar, seguida de digestão com nucleases específicas de uma cadeia única permite o isolamento do ADN IS em forma pura (Ohtsubo e Ohtsubo, 1976; Schmidt et al., 1976). O rápido desenvolvimento de análises de restrição de DNA e métodos de sequenciação permitiram, de fato, a determinação da sequência completa de IS1 (Ohtsubo e Ohtsubo, 1978; Johnsrud, 1979), e IS2 (Ghosal et al., 1979a). A sequência de IS4 está quase completa no momento de escrever este capítulo (R. Klaer et al., unpublished experiments).,técnicas de hibridação ADN–ADN foram utilizadas para procurar a presença de elementos IS no cromossoma E. coli. IS1 e IS2 estão presentes em ∼8 e 5 5 cópias, respectivamente (Saedler e Heiss, 1973). O uso da técnica de blotting de Southern permitiu a determinação exata do número de cópias de IS3 em E. coli K12 , e de IS4 . Além disso, alguns dos elementos IS demonstraram ser transportados no plasmídeo F da fertilidade de E. coli (Davison et al., 1975a), e sobre alguns factores R (Hu et al., 1975).,
os elementos IS não são conhecidos por codificar genes que são traduzidos em proteínas, embora no caso de IS1 a sequência de ADN conhecida Não exclua a possibilidade da tradução em um (poucos) peptídeo (s) de tamanho limitado. O comprimento dos elementos IS exclui a formação de grandes proteínas. Os efeitos conhecidos dos elementos IS são, portanto, limitados à posição, onde estão integrados, e às sequências de ADN adjacentes na posição cis. Estes efeitos estão descritos nas secções seguintes.
outra classe de elementos transponíveis de ADN foi descrita desde 1974., São chamados transposons. Como regra, eles são maiores do que os elementos e são detectados por efeitos que são causados por proteínas codificadas no DNA transposon. The first transposons described encode resistance to antibiotics, and most transposons known carry resistance genes (Datta et al., 1971; Hedges and Jacob, 1974; for reviews, see Cohen, 1976; Kleckner, 1977). Existem, no entanto, transposões que codificam uma enterotoxina E. coli (So et al., 1979), ou genes para a fermentação de lactose (Cornells et al., 1979)., O Tn3, além de transportar um gene para a β lactamase, também carrega genes envolvidos no processo de transposição (Heffron et al., 1977; Gill et al., 1978; Chou et al., 1979). O mesmo parece ser verdadeiro para Tn5 (Berg et al., 1978).transposões são encontrados na natureza como partes de plasmídeos. A transposição entre plasmídeos explica a variabilidade encontrada no que diz respeito à resistência múltipla a fármacos de diferentes plasmídeos. No laboratório, a transposição para o genoma da bacteriofagem foi detectada, bem como a transposição para o cromossoma bacteriano., Nenhum dos transposons conhecidos, no entanto, é um constituinte natural do cromossoma E. coli K12.
A literatura sobre transposões está se expandindo rapidamente, e para uma descrição dos muitos transposons diferentes conhecidos no momento de escrever este artigo, o leitor é referido a revisões mais abrangentes deste tópico.
todos os transposões investigados até agora têm uma estrutura comum: eles carregam uma sequência de DNA repetida em sua termini, e genes de codificação de DNA único entre essas sequências de DNA repetidas. Na maioria dos casos, as sequências de ADN repetidas são invertidas em relação umas às outras., O seu tamanho é variável. Em alguns transposons, as repetições invertidas são de cerca de 1,5 KiB, e há razão para suspeitar que essas sequências são transposíveis independentemente são elementos. In other cases, the repeated DNA is only about 0,15 Kb (e.g., Tn1-3, encoding ampicillin resistance (Heffron et al., 1975; Kopecko and Cohen, 1975).
no caso do Tn9, codifica resistência ao cloranfenicol (McHattie and Jackowski, 1977), e Tn1681, codificando enterotoxina E. coli (So et al., 1979), a sequência repetida no termini é IS1., No último caso, as duas cópias de IS1 são invertidas relativamente uma à outra, enquanto no primeiro caso as duas cópias IS1 são repetições diretas. Como se sabe a partir da sequência de DNA de IS1 que este elemento em si é encerrado por pequenas repetições de DNA não coincidentes, a regra geral que o próprio termini de transposons são invertidos repetições é conservada mesmo para Tn9. Com efeito, no caso da IS2 (Ghosal et al., 1979a) e IS4 (Habermann et al., 1979), repetições invertidas são encontradas em seu termini., A generalidade desta observação pode até implicar um papel destas repetições invertidas no processo de transposição.