PEIXES Testes em Câncer

Câncer refere-se a um complexo e heterogêneo grupo de doenças caracterizado pela descontrolada e desordenada proliferação de células, que muitas vezes adquirem a capacidade de invadir outros tecidos. O cancro origina-se geralmente em células somáticas que, em consequência de uma série de mutações genéticas, evitam os mecanismos que regulam a homeostase tecidular, tais como a inibição do contacto célula-célula, sinais de diferenciação e indução da morte celular., As mutações responsáveis pela transformação do tumor dizem respeito a dois grupos principais de genes, conhecidos como proto-oncogenes (estimuladores do ciclo celular) e supressores tumorais (repressores da progressão do ciclo celular). Estas alterações funcionais podem ocorrer como consequência de mutações nucleotídicas únicas, mas também podem ser causadas por grandes modificações no material genético, tais como inserções, deleções, duplicações ou translocações de um fragmento cromossômico. Estas anomalias nas células cancerosas podem ser usadas como biomarcadores de tumores., A quantificação de alterações no número de cópias de genes ou re-arranjos de genes é fundamental para a nossa compreensão da biologia tumoral, daí a importância dos testes genéticos com base no perfil da citogenética molecular.

O que é o peixe ?a hibridização por fluorescência in situ (FISH) é uma técnica citogenética utilizada para a detecção e localização de sequências de nucleótidos (ADN ou ARN) dentro de tecidos ou células., Os peixes podem ser utilizados para “mapear” o material genético em células humanas, fornecendo informações sobre a localização, comprimento e número de cópias de genes específicos ou porções cromossómicas. Ele requer a síntese de uma sonda marcada fluorescentemente, que é uma sequência de ácido nucleico ligada a uma molécula fluorescente repórter, que então se liga (hibridação) a uma sequência específica de alvo. Sondas de peixes podem ser rotuladas por vários métodos (por exemplo, tradução de nick, iniciação aleatória), a partir de diferentes entradas de ácidos nucleicos, como DNA genômico/RNA, cromossomos artificiais bacterianos (BACs), ou cosmídeos.,
O primeiro passo no processo FISH é imobilizar a propagação cromossômica da metafase ou células interfásicas contendo o DNA alvo em uma lâmina de vidro. Em seguida, tanto a amostra de DNA como a sonda de peixes são desnaturados pelo calor. Quando a sonda está em contato com o material genético alvo, ela se ligará especificamente à sua sequência complementar no cromossomo. Híbridos formados entre as sondas e seus alvos de sequência podem então ser visualizados usando um microscópio fluorescente (Figura 1)., Em geral, dois tipos de sondas de peixes podem ser distinguidos: as sondas de enumeração cromossômica (CEPs ou CENs) visando as regiões pericentroméricas do cromossomo e usadas para enumerar cromossomos; e indicadores específicos de locus (LSI) reconhecendo especificamente genes de interesse.

Figura 2: Exemplo de PEIXE resultados: Nick Tradução de DNA Labeling System 2.0 foi usado para rotular BAC de sondas de DNA para TP53 com SEEBRIGHT® Laranja 552 dUTP e BAC de sondas de DNA para Centrômero 17 com SEEBRIGHT® Green 496 dUTP., Sondas rotuladas foram hibridizadas para se espalhar por metafase. (Institut Universitaire du Cancer Toulouse Oncopole)

FISH has several advantages over other classical cytogenetic techniques, such as G-banding karyotyping. Em primeiro lugar, tem uma resolução mais elevada (20-150kb vs 5Mb). Além disso, o peixe pode ser aplicado tanto aos cromossomas metafase como interfase, o que significa que as células não precisam de ser cultivadas durante vários dias antes de os cromossomas poderem ser preparados para análise., Isto também implica que o peixe é adequado para a análise de diferentes tipos de amostras, incluindo tumores sólidos e tecidos parafínicos fixos em formalina (FFPE). Além disso, sondas de peixes podem ser rotuladas com diferentes fluoróforos, permitindo o monitoramento simultâneo de vários locais.

aberrações cromossómicas em peixes no cancro

graças à sua versatilidade, FISH pode ser utilizado para a análise citogenética de ambos os tumores sólidos (por exemplo, cancro da mama, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro colorectal) e hematológico ou cancro do sangue (por exemplo, leucemia, linfomas, mieloma múltiplo)., A detecção de anomalias genéticas é útil não só para o câncer, mas também como uma ferramenta para analisar a predisposição genética e informações específicas da doença, e para prever um resultado quimioterapêutico.o câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer. Em particular, o cancro do pulmão de células não pequenas (CPNPC) representa cerca de 80-85% de todos os cancros do pulmão. Mutações somáticas nos genes EGFR e ALK são frequentemente associadas ao NSCLC., EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) é uma classe de receptores da tirosina cinase cuja atividade é desregulada em diferentes tipos de doenças malignas epiteliais (incluindo câncer de pulmão), uma vez que eles desempenham um papel importante na proliferação de células cancerosas, angiogênese e metástase. Por esta razão, estratégias diferentes para interferir com a função EGFR são comumente exploradas para a terapia dos pacientes. Os inibidores da actividade da tirosina cinase destes receptores (por exemplo, erlotinib, gefitinib) são amplamente utilizados nos tratamentos clínicos do CPNPC., Infelizmente, devido à variedade de mutações genéticas subjacentes à disfunção EGFR, alguns pacientes são insensíveis a este tipo de tratamento. Diferentes grupos de pacientes podem realmente ser distinguidos com base no tipo de alteração realizada pelo EGFR, tais como amplificação genética, supressão ou substituições nucleotídicas únicas, que podem alterar a sua actividade de diferentes formas (ou seja, não através do domínio da tirosina cinase). Como resultado, o número de cópia EGFR determinado pelo FISH é um dos biomarcadores utilizados para selecionar a terapia correta.,FISH é comumente usado para detectar inversões ou translocações no gene ALK. O gene ALK está localizado no braço curto do cromossomo 2 (2p23) e codifica para o receptor transmembranar de tirosina cinase. O ALK não deve ser expresso no pulmão adulto. No entanto, em condições patológicas, o gene ALK quebra e funde o seu 3′ (contendo o domínio da tirosina cinase) com o 5′ de outros genes. Este evento pode levar à ativação descontrolada de vias de sinalização a jusante ALK. A fusão mais comum ocorre com o EML4, por causa de uma inversão no braço curto do cromossomo 2.,FISH é o método aprovado pela FDA para detectar inversões ou translocações no gene ALK. Tipicamente, sondas direcionadas para a Região 3′ e 5′ do gene são rotuladas com diferentes fluoróforos: em núcleos negativos, as cores aparecerão próximas umas das outras (muitas vezes sobrepostas), enquanto nas células cancerosas os sinais se dividirão como resultado do rearranjo cromossômico (Figura 4).

Uma terceira sonda direccionada para o potencial parceiro ALK poderia confirmar e definir o rearranjo cromossómico que ocorre num doente (figura 4C)., Os cancros pulmonares que albergam mutações que conduzem à hiperactivação do ALK podem ser tratados com inibidores do ALK, tais como o Crizotinib. esta é a doença maligna mais comum em mulheres e a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. O câncer de mama é muitas vezes caracterizado por anormalidades no estado receptor, levando a uma elevação das vias de transdução celular responsáveis pela proliferação celular e sobrevivência. Em particular, aproximadamente 20-30% dos tumores do câncer de mama são conhecidos por sobreexpressar HER2/Neu, um membro da família EGFR., Um tratamento comum nestes casos é Trastuzumab, um anticorpo monoclonal humanizado aprovado pela FDA em 1998 para o tratamento do cancro da mama. O seu mecanismo molecular EXACTO permanece por esclarecer, mas este anticorpo provavelmente impede a activação do HER2 ligando-se ao seu domínio extracelular. Além disso, parece induzir lise celular tumoral estimulando a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). FISH, usando uma sonda apropriada contra HER2, pode ser usado para identificar cópias extras do gene, um sinal de que é mais provável responder ao tratamento com Trastuzumab.,

FISH for Bladder Cancer

It is the fifth most common human malignancy and the second most frequently diagnosticed genitourinary tumor after Próstata cancer., É uma doença poligênica, o que significa que tem sido associada a várias anomalias genéticas, tais como mutações em genes FGFR3, RB1, HRAS, TP53 ou TSC1. No entanto, o evento de iniciação é provavelmente uma mutação na região 9p21, contendo o gene p16 / CDKN2A. Além disso, as células cancerosas da bexiga são caracterizadas por um elevado grau de instabilidade cromossômica (CIN). A duplicação ou segregação de cromossomas disfuncionais durante a mitose provoca rearranjos e translocações de ADN, ganho ou perda de cromossomas inteiros (aneuploidia) ou fragmentos de cromossomas., O desequilíbrio resultante do material genético agrava-se após cada ciclo celular. Os consequentes padrões genômicos podem estar relacionados com os diferentes estágios de desenvolvimento do tumor, com as formas mais invasivas mostrando o maior número de alterações citogenéticas.as alterações cromossômicas estruturais e numéricas encontradas em células cancerosas da bexiga podem ser usadas como marcadores tumorais.especificamente, a detecção simultânea da variação do número de cópias dos cromossomas 3, 7 e 17 e a eliminação da região 9p21 (contendo p16) por peixes usando quatro sondas distintas é uma prática comum., Este método é útil para fornecer informações sobre a progressão e recorrência do câncer.

PEIXE para a Leucemia Linfocítica Crônica (CLL)

Análise de malignidades hematológicas é um dos exemplos típicos das vantagens de PEIXES para a análise de amostras caracterizado por uma variável de cariótipo e um baixo mitotic atividade.
= = ligações externas = = Não foi associada a uma alteração genética recorrente específica., Em vez disso, semelhante ao cancro da bexiga, um painel de diferentes mutações tem sido associado a diferentes graus de gravidade da doença e são utilizados como indicadores preditivos da evolução clínica do doente. Os painéis de peixes, neste caso, incluem frequentemente sondas para detectar trissomia 12 e supressões 11q, 13q e 17p., Exclusão 11q, que na maioria dos casos, as preocupações, o gene ATM, é encontrada em pacientes mostrando uma rápida progressão do câncer; a trissomia do cromossomo 12 está associado com estágios avançados da doença, a resistência à quimioterapia e menor sobrevida vezes; eliminação 13q é o mais comumente encontrado e está em geral associada a um prognóstico mais favorável; eliminação 17p muitas vezes, inclui a eliminação do gene TP53 e corresponde ao estágio avançado do tumor, com uma fraca taxa de sobrevivência.Enzo Life Sciences é um líder global em tecnologias de rotulagem de DNA e RNA., Oferecemos uma gama de produtos para suas necessidades de pesquisa de Genômica e câncer. Para um método simples e eficiente para a geração de DNA rotulado, por favor, confira nosso kit de rotulagem de DNA de tradução Nick, bem como uma lista de nossos tinteiros fluorescentes SEEBRIGHT® e nosso Allylamine-dUTP. Não sabe se deve usar biotina ou digoxigenina para a rotulagem da sonda ISH? Podemos ajudar-te lá! Não se esqueça de verificar o espectador de Espectros do Enzo para obter perfis de excitação e emissão de comprimentos de onda de corantes comuns e os nossos outros testes baseados em células fluorescentes., Já agora, por favor, verifica a nossa tecnologia sobre os prós e contras dos peixes, do aCGH e do NGS e como usar alilamina-dUTP para a etiquetagem de ADN de peixe. Para todas as questões e preocupações relativas a qualquer um dos nossos produtos, a nossa equipa de apoio técnico está aqui para ajudar.