O que é a electroforese em Gel de poliacrilamida (página)?

Eletroforética técnicas de separar moléculas carregadas em um campo elétrico. A mobilidade de uma molécula é inversamente proporcional ao seu tamanho e diretamente proporcional à sua carga. Durante a eletroforese, as proteínas movem-se para um eletrodo carregado de forma oposta em um campo elétrico.,

A velocidade do seu movimento num sistema electroforético é regida por vários factores, tais como temperatura, pH e concentração do tampão, para além de propriedades intrínsecas, tais como o tamanho, carga e forma das proteínas.a separação electroforética das proteínas, estritamente com base no seu peso molecular, só é possível se a carga de todas as moléculas proteicas puder ser manipulada ao mesmo sinal. Nesse caso, a mobilidade das moléculas proteicas dependerá unicamente do seu tamanho.,

a electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é uma técnica baseada nesta ideia e é utilizada para separar proteínas com base no seu tamanho.

princípios da página

na página, um detergente aniónico chamado sulfato de sódio dodecilo (SDS) é usado para se ligar às proteínas e dar-lhes uma carga negativa. As proteínas são então separadas eletroforeticamente de acordo com o seu tamanho usando uma matriz de gel feita de poliacrilamida em um campo elétrico.a poliacrilamida é produzida como resultado da reacção de polimerização entre a acrilamida e N,n’-metileno-bis-acrilamida (BIS) utilizando um catalisador., O grau de polimerização ou de ligação cruzada pode ser controlado ajustando a concentração de acrilamida e BIS.

Quanto mais a ligação cruzada mais difícil o gel. A dureza do gel, por sua vez, modula o atrito experimentado pelas macromoléculas quando viajam através do gel durante a página, afetando assim a resolução da separação.géis soltos (4-8% de acrilamida) permitem que moléculas de maior peso molecular migrem mais rapidamente através do gel, enquanto géis duros (12-20% de acrilamida) restringem a migração de moléculas grandes e permitem selectivamente que as pequenas se movam através do gel.,

SDS-PAGE protocol

1. Preparação da amostra: As amostras de proteínas são desnaturadas aquecendo-as com detergente SDS e mercaptoetanol. O primeiro liga-se fortemente às proteínas e dá-lhes uma carga negativa elevada, enquanto o segundo liberta grupos sulfidril, produzindo assim cadeias polipeptídicas carregando uma carga negativa excessiva e uma carga similar à razão massa. Isto ajuda a resolução de proteínas estritamente com base no seu tamanho durante a electroforese em gel.2., Preparação do Gel:

o gel electroforético tem normalmente vários componentes, incluindo acrilamida, BIS e um tampão. A mistura é desgaseificada para evitar a formação de bolhas durante a polimerização do gel. Persulfato de amônio, uma fonte de radicais livres, e um estabilizador são adicionados para iniciar a polimerização. O BIS é também adicionado para formar ligações cruzadas entre moléculas de acrilamida até que um gel seja formado.3. Eletroforese:

Como uma corrente elétrica é aplicada, as proteínas migram através do gel para o eletrodo positivo, uma vez que têm uma carga negativa., Cada molécula move – se a uma taxa diferente com base no seu peso molecular-as pequenas moléculas movem-se mais rapidamente através do gel do que as maiores. A migração é geralmente mais rápida em altas tensões. Após algumas horas, as moléculas proteicas são todas separadas pelo tamanho.4. Coloração e visualização:

Uma vez que a eletroforese esteja completa, o gel pode ser manchado usando corantes coloridos, como Coomassie azul brilhante ou brometo de etídio para fazer as proteínas separadas aparecerem como faixas coloridas distintas no gel.o corante não ligado é lavado do gel., Os géis manchados são então secos para que a intensidade de cor das bandas proteicas possa ser medida. Bandas de proteínas radioativas podem ser detectadas por autoradiografia. As proteínas também podem ser quantificadas, pois o teor proteico é diretamente proporcional à quantidade do corante ligado.alguns sistemas de gel introduzem um corante de rastreamento, como o azul de bromofenol, juntamente com a amostra de proteína – a distância visível percorrida pelo corante no gel ajuda a decidir a duração necessária da eletroforese., Azul de bromofenol viaja junto com as moléculas de amostra até que ele eventualmente alcança o fundo do gel. A electroforese tem de parar neste ponto para garantir que nenhuma molécula proteica electroforese sai do gel e entra no tampão.

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