a Verificação Experimental de Modelos
A primeira abordagem (3) identificou os principais iniciação sites em 14 de proteínas, incluindo bovinos pancreática RNase A e cachalote mioglobina, e também outros menos estável de início de sites (11) em RNase A. O principal iniciação site para RNase Um foi identificado neste modelo como resíduos 106-118. A aplicação da segunda abordagem (8) à RNase A (13) conduziu a seis sítios (ilustrados na Fig., 3 a), que eram coerentes com as identificadas (11) pela primeira abordagem (3). Estes são resíduos 4-11 (região A), resíduos 25-34 (região B), resíduos 51-57 (região C), e antiparallel estruturas (não necessariamente plissado folhas) formadas pela associação de resíduos 53-67 com resíduos 69-79 (região D), resíduos 71-90 com resíduos 91-111 (região E), e resíduos de 103-111 com resíduos 115-124 (região F). Os passos subsequentes ao longo da via dobrável consistem no crescimento ou coalescência destas regiões. A região G é formada quando os resíduos são 36 a 48 vezes superiores à hélice B., Região G, no entanto, contém mais de gama contatos que não hélice B. Portanto, G é considerada uma fase posterior de B. Região L é formado pela associação de Uma região com a, B, G e C. estrutural sequência é seguido pela região H, formado quando as regiões C e D entrar em contato; por região K que contém os contactos entre regiões e e F; por região J em que regiões C e D do formulário de contatos com regiões e e F; e por região I que contém os contactos das regiões e e H com G. Finalmente, a região M é formado quando Uma região entra em contato com o e e F.,
O previsto primária de dobramento de iniciação site de RNase Um é de acordo com o observado vez de resíduos 113 e 114 do nativo molécula, com o alto grau de conservação da apolar resíduos no site 106-118, de 23 espécies de mamíferos desta proteína (3), e com informações experimentais sobre intermediários detectados no térmica desdobramento de RNase A (14)., RNM de provas para estrutura local em desdobrado RNase sob condições de dobramento (15), e fragmentos dos mesmos (16), e imunoquímicos estudos sobre a formação de estabilidade antigênica sites (na superfície da proteína, cobrindo enterrado principal hidrofóbico iniciação site quando reduzido RNase Um é oxidado (ref. 17 e figura 8 de ref. 18), foram também consistentes com esta imagem. Na ref são apresentados outros elementos de prova experimentais que comprovem a existência dos locais de início A-F. 11.,
para a apomioglobina, a primeira abordagem (3) identificou o local de início primário de dobragem como resíduos 103-115, que engloba a maior parte da hélice G, com a sequência Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-ser-Glu-Ala-Ile-his-Val-Leu., Aplicação da segunda abordagem (8), e conformações de energia cálculos, levou à sugestão de que as interações entre o A, G, e H hélices de apomyoglobin pode ser importante para dobramento de iniciação (19), consistente com os resultados experimentais que implicados nessas regiões em equilíbrio intermediários de apomyoglobin (20) e nos primeiros cinética passos no dobramento caminho (21). Estudos experimentais recentes de mutantes da mioglobina (22, 23) fornecem apoio convincente para modelos que incorporam iniciação hidrofóbica e propagação da dobra.,a Apomioglobina tornou-se um paradigma para a investigação sobre vias dobráveis (24). Parte da molécula de apomioglobina, consistindo nas hélices A, G, H e parte da hélice B, dobra-se rapidamente para formar uma via intermediária, com o restante da cadeia polipeptídica dobrando a uma velocidade mais lenta, da ordem de segundos (21, 25). Os fragmentos peptídicos da apomioglobina correspondentes às hélices G E H mostraram uma propensão para a estrutura helicoidal (26-28), enquanto os peptídeos correspondentes ao restante da proteína mostraram uma propensão muito mais baixa para a formação da hélice (29)., No entanto, uma experiência em que a hélice H da mioglobina foi alterada para diminuir a sua propensão helicoidal (30) mostrou muito pouca influência na taxa de dobragem da proteína. Um efeito muito maior foi observado quando a histidina distal (H64) foi alterada para fenilalanina: a substituição de uma cadeia lateral não-polar para a histidina polar enterrada resultou num aumento significativo na taxa de dobragem (31). Estes estudos apontaram para a importância do empacotamento em cadeia lateral, particularmente nas superfícies de contato das hélices, para a taxa de dobragem da apomioglobina.,
Apomioglobina tem a vantagem de que pode ser estudado no equilíbrio sob uma série de condições da solução que se aproximam de alguns dos estágios observáveis na Via dobrável cinética. Assim, tem sido possível definir as propensidades conformacionais de apomioglobina não dobrada e parcialmente dobrada por NMR (32-35). Curiosamente, a apomioglobina sem ácido mostra uma propensão para a estrutura helicoidal não-nativa em uma região que conecta as hélices D E E, bem como a estrutura nativa observada nas hélices A E H, que tinha sido prevista nos estudos cinéticos (34)., A RNM de estudos de conformacional propensões das várias formas de apomyoglobin (32-35) incluiu a determinação do relaxamento parâmetros da cadeia polipeptídica para o site-determinar especificamente a espinha dorsal dinâmica em cada um dos estados da proteína. Em vez da análise” sem modelo ” que é adequada para proteínas dobradas, os dados de relaxamento foram analisados calculando funções de densidade espectral reduzida J(0), J(wN) e J(wH) (36). A função J (0) informa sobre os movimentos da escala temporal µs–ms e sugeriu que, para a apomioglobina em pH 2.,3, as hélices A E G estavam fazendo contatos transitórios (34). Este resultado emocionante, mais tarde validado por estudos spin-label NMR (37), forneceu evidências definitivas de contatos nativos de longo alcance em uma proteína não dobrada. Ainda mais intrigante, a função J( wN), que informa sobre o movimento em escala de tempo ps–ns, mostrou variação sequencial, que pode ser correlacionada com a variação em um parâmetro calculado, a “área média enterrada ao dobrar” (AABUF) (10)., Este parâmetro, que incorpora tanto o resíduo de tamanho e hidrofobicidade, é definido por aminoácidos individuais, mas geralmente é em média mais de uma janela de cinco a nove de resíduos na sequência e fornece uma alternativa estimativa quantitativa da hidrofobicidade definido por Matheson e Scheraga (3) em termos da energia livre de formação. No caso da apomioglobina a pH 2.3, Picos na parcela de J (wN) vs., o número de resíduo, que indica a restrição do movimento da escala temporal sub-ns, correspondia extremamente bem com picos na parcela AABUF, que indicam um número maior do que a média de aminoácidos grandes e/ou não-polares. Esta observação sugere que existe um padrão na sequência de aminoácidos, definida por agrupamentos de grandes e / ou cadeias laterais não-polares, como no modelo de ref. 3, que leva à restrição do movimento da espinha dorsal polipeptídica causada pela formação de aglomerados hidrofóbicos locais.Apomioglobina a pH 2.,3 retém uma pequena propensão para a estrutura helicoidal nas hélices A E H, como avaliado pelas mudanças químicas NMR observadas (34). Estas propensões são abolidas na presença de 8 m de ureia (35), mas a dependência sequencial das taxas de relaxamento da apomioglobina desnaturada pela ureia também mostra uma intrigante correlação com o parâmetro AABUF. Neste caso, a correlação é entre mínimos em J(wH) e maxima de AABUF, sugerindo que interações hidrofóbicas locais que restringem o movimento da coluna vertebral em escalas de tempo sub-ns são persistentes mesmo em 8 m de ureia.,
para testar a hipótese de que o parâmetro AABUF, isto é, hidrofobicidade, poderia ser usado para prever os locais de iniciação dobráveis na cadeia polipeptídica, um conjunto específico de mutações de apomioglobina foram feitas (23). A hélice a, que participa do intermediário cinético que é formado pela primeira vez ao dobrar da apomioglobina WT, tem uma sequência que dá origem a um máximo no parâmetro AABUF, enquanto a hélice E, que é de fato altamente hidrofóbica de acordo com as escalas de hidrofobicidade convencionais, tem um AABUF bastante baixo ao longo de seu comprimento., Em apomioglobina dobrada, a cadeia lateral de Trp-14, na hélice A, encontra-se em frente à espinha dorsal da hélice E em Gly-73. Uma mioglobina mutante dupla foi preparada, em que Trp-14 foi substituído por Gly, e Gly-73 foi substituído por Trp. Foi fundamentado que a estrutura dobrada da proteína deve ser minimamente perturbada por esta troca, mas que o parâmetro AABUF para os hélices A E E deve ser drasticamente afetado. A questão era se a via dobrável também seria afetada. De facto, a dobragem do mutante em que o G73 e o W14 são trocados ocorre por uma via diferente da proteína WT., Todas as variantes de apomioglobina que até agora foram estudadas vezes através de uma fase de ruptura intermédia que contém estrutura helicoidal. No caso da apomioglobina WT, este intermediário contém as hélices A, G E H (e também parte da hélice B). No mutante swap G73-W14, o intermediário contém as hélices E, G E H; A hélice a não é protegida na fase inicial de dobragem, mas dobra mais tarde. Este resultado (ilustrado na Fig. 4) foi confirmado por estudos spin-label que mostraram contactos entre as hélices E, G E H no mutante, em vez dos contactos A, G E H observados na proteína WT.,