Este material é acompanhado por uma apresentação sobre a estrutura proteica e os princípios subjacentes às amostras de desnaturação e à electroforese em gel descontínua.
a separação das macromoléculas num campo eléctrico é chamada electroforese. Um método muito comum para a separação de proteínas por electroforese utiliza um gel de poliacrilamida descontínuo como meio de suporte e sulfato de dodecilo de sódio (SDS) para a desnaturação das proteínas. O método é chamado dodecilsulfato de sódio poliacrilamida gel electroforese (SDS-PAGE)., O sistema mais comumente usado é também chamado de método Laemmli após o Reino Unido Laemmli, que foi o primeiro a publicar um artigo empregando a página SDS em um estudo científico.
SDS (também chamado sulfato de lauril) é um detergente aniônico, significando que quando dissolvida suas moléculas têm uma carga negativa líquida dentro de uma ampla gama de pH. Uma cadeia polipeptídica liga quantidades de SDS em proporção à sua massa molecular relativa. As cargas negativas sobre SDS destroem a maior parte da estrutura complexa de proteínas, e são fortemente atraídas para um ânodo (eletrodo positivamente carregado) em um campo elétrico., géis poliacrilamida retêm moléculas maiores de migrar tão rápido quanto moléculas menores. Uma vez que a relação carga-massa é quase a mesma entre os polipeptídeos desnaturados SDS, a separação final das proteínas depende quase inteiramente das diferenças na massa molecular relativa dos polipeptídeos. Em um gel de densidade uniforme, a distância de migração relativa de uma proteína (Rf, o f como um índice) é negativamente proporcional ao log de sua massa., Se proteínas de massa conhecida são executadas simultaneamente com as incógnitas, a relação entre Rf e massa pode ser traçada, e as massas de proteínas desconhecidas estimadas.
separação de Proteínas por SDS-PAGE pode ser usado para estimar a massa molecular relativa, para determinar a abundância relativa dos principais proteínas em uma amostra, e para determinar a distribuição de proteínas entre frações. A pureza das amostras de proteínas pode ser avaliada e o progresso de um processo de fraccionamento ou purificação pode ser seguido., Diferentes métodos de coloração podem ser usados para detectar proteínas raras e aprender algo sobre suas propriedades bioquímicas. Técnicas especializadas como Western blotting, electroforese bidimensional e mapeamento peptídico podem ser usadas para detectar produtos genéticos extremamente escassos, para encontrar semelhanças entre eles, e para detectar e separar isoenzimas de proteínas.
massa Molecular versus massa molecular
massa Molecular (Símbolo m) é expressa em Daltons (Da). Um Dalton é definido como 1/12 a massa de carbono 12., A maioria das macromoléculas são grandes o suficiente para usar o kiloDalton (kDa) para descrever a massa molecular. O peso Molecular não é o mesmo que a massa molecular. É também conhecida como massa molecular relativa (símbolo Mr, onde r é um subscrito). O peso Molecular é definido como a razão entre a massa de uma macromolécula e 1/12 a massa de um átomo de carbono 12. É uma quantidade adimensional.
Quando a literatura dá uma massa em Da ou kDa refere-se à massa molecular. É incorrecto exprimir o peso molecular (massa molecular relativa) em Daltons., No entanto, você vai encontrar o termo peso molecular usado com Daltons ou kiloDaltons em alguma literatura, muitas vezes usando a abreviação MW para peso molecular.
géis de poliacrilamida para SDS-PAGE
muitos sistemas para electroforese proteica foram desenvolvidos, e os aparelhos usados para SDS-PAGE variam muito. A metodologia utilizada nestas páginas utiliza o método Laemmli. A referência ao método Laemmli numa secção de materiais e métodos elimina a necessidade de descrever os tampões, o vazamento de géis, aparelhos, etc., A menos que o papel utilize alguma modificação do método, os únicos detalhes da SDS-PAGE que devem ser relatados em uma seção de métodos são percentagem total de acrilamida (%T) em um gel, porcentagem relativa e tipo de crosslinker (%C), e talvez uma referência às dimensões do gel. Usamos um sistema “mini-gel”, com 3 1/4″ x 4 ” cassetes de gel.
SDS-PAGE pode ser conduzido em géis pré-moldados, poupando o trabalho e o perigo de trabalhar com acrilamida. A descrição que se segue aplica-se aos aparelhos de fundição e de rolamento fabricados em estabelecimentos comerciais que sejam muito mais baratos do que os equipamentos comercialmente disponíveis., Além da relação custo-eficácia, uma vantagem de fazer o géis próprio pela primeira vez é uma compreensão mais profunda do processo. independentemente do sistema, a preparação requer a colocação entre placas de vidro de duas camadas diferentes de acrilamida. A camada inferior (separando, ou resolvendo, gel) é responsável por realmente separar polipeptídeos por tamanho. A camada superior (gel de empilhamento) inclui os poços de amostra. Ele é projetado para varrer proteínas em uma amostra entre dois limites móveis de modo que eles são comprimidos (empilhados) em camadas finas micrômetro quando eles chegam ao gel separador.,