Fronteiras em Ciência Veterinária

Introdução

Invertebrados incluem cerca de um milhão de espécies animais mantidos tanto em instituições zoológicas e em famílias onde eles são mão levantada como animais de estimação exóticos (1). Os gastrópodes compreendem cerca de 60.000 espécies de moluscos aquáticos e terrestres, principalmente caracóis e lesmas (1). O caracol gigante da Terra Africana (Achatina fulica, sin., Lissachatina fulica é uma espécie nativa da África Oriental, no entanto, é uma espécie invasora generalizada na Ásia, Oceania e, mais recentemente, nas Américas, onde foi introduzida acidentalmente ou propositadamente como uma fonte de alimento e como um animal de estimação. Sua liberação em ecossistemas naturais, áreas agrícolas e urbanas resultou em ameaças ecológicas, de saúde e agrícolas (2, 3). O caracol terrestre gigante é um hospedeiro intermediário para vários parasitas, incluindo Aelurostrongylus abstrususus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp.,, e Fasciola hepatica (4, 5). Todos os helmíntios acima, com exceção de A. abstrusus, são capazes de causar doenças graves em seres humanos. Especificamente, o caracol terrestre gigante africano é o principal responsável pela disseminação mundial de A. cantonensis que causa meningoencefalite eosinofílica humana na Ásia e nas Américas (2, 6). Os factores de risco para a infecção nos seres humanos, animais de estimação e vida selvagem por esses parasitas helmínticos incluem a ingestão de caracóis ou lesmas infectados crus ou subcotados, ou alimentos contaminados pelo lodo de caracóis ou lesmas infectados (4, 5, 7, 8).,embora os caracóis terrestres gigantes africanos estejam entre os mais populares como animais de estimação, e sua popularidade mundial como animais de estimação exóticos está crescendo rapidamente, apenas algumas pesquisas foram realizadas sobre a ocorrência de seus parasitas em condições naturais (2, 6, 9-11). O objectivo deste inquérito era investigar a ocorrência de parasitas em caracóis terrestres gigantes africanos criados como animais de estimação no sul de Itália.,em agosto de 2018, foram investigados por parasitas três conjuntos de amostras fecais frescas obtidas de um total de 60 caracóis terrestres africanos gigantes, mantidos em três colecções privadas diferentes localizadas em Pozzuoli, Caserta e Nápoles (Itália). A partir de cada localidade obtivemos uma piscina de fezes de 20 caracóis individuais cada. Os caracóis incluídos neste estudo tinham uma idade média de 1,6 anos variando de 0,2 a 2 anos e não tinham recebido qualquer tratamento anti-parasitário anterior., Os caracóis eram alimentados com legumes frescos e frutas; além disso, uma suplementação em pó de cálcio (Calcium, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Alemanha) foi fornecido duas vezes por semana. Todos os animais foram criados em Itália, propriedade privada e mantidos como animais de estimação em quatro terrários interiores de 60 × 30 × 45 cm de tamanho, em grupos de 10-20 animais (2 grupos de 20 caracóis em Pozzuoli e Caserta e 2 grupos de 10 caracóis cada em Nápoles)., Foi utilizado como substrato um solo orgânico de turfa (solo orgânico de turfa do Coco, E-Coco Products, Gloucestershire, Reino Unido), previamente tratado termicamente (100°C durante 30 minutos) e depois isento de parasitas e insectos.foram inicialmente obtidos 20 gramas de fezes frescas de cada um dos quatro terrários., Quando as fezes agrupadas analisadas por esfregaço fresco, o teste de flotação e Baermann mostrou positividade aos nemátodos rabidídeos, dois caracóis de cada terrário positivo foram alojados individualmente numa caixa de plástico estéril, e as suas fezes foram recolhidas, imediatamente após a defecação, num tubo de plástico estéril de 50 ml. O exame coprológico para amostras agrupadas e individuais incluiu esfregaço fresco, flotação centrífuga (2 g de fezes para cada teste) utilizando uma solução de açúcar e formaldeído (gravidade específica 1,27) e teste de Baermann (10 g de fezes para cada teste)., Além disso, o muco obtido durante o exame de esfregaço fresco foi analisado sob um microscópio de luz. Uma vez que as formas larvares de várias espécies de hortelã podem se alojar dentro do músculo do pé dos caracóis, o exame histológico de amostras de biopsia colhidas das áreas anterior e posterior do músculo do pé foi realizado em 30 caracóis, anestesiados com a técnica descrita por Giannelli et al. (12) e Gilbertson e Wyatt (13)., As amostras de biópsia foram fixadas em formalina neutra com tampão fosfato de 10%, e processadas por métodos de rotina em blocos de parafina que foram cortados em secções de 3 µm de espessura, e manchadas com hematoxilina e eosina. O estudo foi realizado com a permissão da prática em que ocorreu e sob o consentimento do proprietário informado e assinado.

identificação morfológica

montagens temporárias foram feitas por nemátodos que matam o calor em lâminas de vidro numa gota de água, após o que foi aplicado um deslizamento de cobertura de vidro., Os nemátodos foram transferidos para uma gota de água da torneira numa lâmina de vidro e colocados num aquecedor (100°C) durante 10 s. estes espécimes foram utilizados para identificação morfológica. Um microscópio amplificado, Carl Zeiss Jena, e um Leitz Diaplan com óptica Nomarski foram usados para observação., Identificação morfológica de rhabditid nematóides seguido de Andrassy (14) e Andrassy (15) e foi baseada principalmente sobre a morfologia da faringe e do estoma, e o sistema reprodutivo, principalmente as características de espículas, número e posição das papilas ou da presença e da forma ou tamanho de bursa para os homens; e a cauda a forma, a posição da vulva e a morfologia do sistema reprodutor feminino. A identificação das larvas foi baseada na forma da cauda.

A Análise Molecular

o ADN foi extraído de espécimes de nemátodos obtidos a partir de fezes fixadas em etanol a 96% colhido nas três localidades., Os nemátodos foram lavados em água duplamente destilada (ddH2O) durante a noite, antes da análise molecular, para remoção completa dos resíduos de etanol. Cada nematoides foi transferido para um Eppendorf estéril tubo (200 µl) com 20 µl de tampão de extracção (17.7 µl de ddH2O, 2 µl de 10 × concentrado de tampão PCR, de 0,2 µl de 1% Tween 20 e 0,1 µl de proteinase K). Os tampões de choque e os nemátodos foram congelados a -20°C durante 20 minutos e, em seguida, incubados imediatamente a 65°C durante 1 h, seguidos de 10 minutos a 95 ° C., Os lisados foram arrefecidos em gelo e depois centrifugados (2 min, 9,000 g); para PCR foi utilizado 1 µl de sobrenadante.

Um fragmento de rDNA contendo as regiões internas transcritas do espaçador (ITS1, 5.8 s, ITS2) foi amplificado usando primers 18S: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (forward), e 28S: 5′-TTCG CCG TTA CTA AGG-3′ (reverso) (16). Um fragmento de rDNA contendo o gene para 18S rRNA foi amplificado usando primers 22F: 5′- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3′ (forward), e 1080JR: 5′- TCC TGG TGGC CCT TCC GTC AAT TTC-3′ (reverso) (17). O PCR master mix consistia em: ddH2O, 7.,25µl; tampão de 10 × PCR, 1,25 µl; trifosfatos de desoxinucleósidos( dNTPs), 1 µl; 0,75 µl de primer dianteiro e reverso; polimerase, 0,1 µl; e 1 µl de extrato de ADN. A PCR perfis foram utilizados da seguinte forma: para o SEU 1º ciclo de 94°C por 7 min, seguido de 35 ciclos de 94°C por 60 s, 50°C por 60 s e 72°C por 60 s, e um alongamento final a 72°C por 7 min (14); para 18 ANOS 1 ciclo de 94°C por 5 min, seguido de 35 ciclos de 94°C por 60 s, 55°C por 90 s e 72°C por 2 min e um alongamento final a 72°C por 10 min., Os produtos PCR foram sequenciados pela GATC Biotech (Alemanha) e posteriormente editados e carregados para o GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

resultados

o teste de Baermann revelou a presença de larvas de nemátodo, cujo comprimento variou entre 170 e 336 µm, em todas as amostras. Os ovos, as larvas e os nemátodos rabidídeos adultos foram detectados por métodos de esfregaço e de flutuação frescos em todas as amostras fecais. Rhabditella axei (Figura 1) foi identificada morfologicamente a partir de duas de três amostras fecais agrupadas e individuais de Pozzuoli e Nápoles. Além disso, Rabditis terricola, Cruznema sp.,, e Pristionchus entomophagus foram isolados de uma piscina e amostras fecais individuais de Caserta. Não foram detectados parasitas nas amostras de biopsia muscular ou no muco.