A definição de electroforese em Gel
a electroforese em Gel é um procedimento utilizado para separar as moléculas biológicas por tamanho. A separação destas moléculas é conseguida colocando-as em um gel com pequenos poros e criando um campo elétrico através do gel. As moléculas movem-se mais rápido ou mais devagar com base no seu tamanho e carga eléctrica.,
Visão Geral da electroforese em Gel
o processo de electroforese em gel funciona porque moléculas carregadas negativamente se afastam do pólo negativo da corrente elétrica e moléculas menores se movem mais rápido que moléculas maiores. Assim, uma separação de tamanho é alcançada dentro do conjunto de moléculas que correm através do gel. O gel funciona de forma semelhante a uma peneira separando partículas por tamanho. A eletroforese trabalha para mover as partículas, usando sua carga elétrica inerente, através da peneira.,
Quando os pesquisadores estão tentando distinguir entre diferentes segmentos de DNA, por exemplo, o processo é simples. As amostras são carregadas em canais no início do gel. Cada molécula de DNA tem a mesma carga (-1), porque o DNA é formado pelos mesmos 4 nucleótidos e sempre carrega uma carga ligeiramente negativa, independentemente de seu tamanho. Portanto, cada molécula de DNA terá a mesma força puxando-a através do gel.no entanto, o tamanho de cada molécula impede o seu progresso através do gel., Moléculas grandes atingem partes da matriz de gel, e são abrandadas. Pequenas moléculas de DNA podem deslizar entre os vários componentes da matriz de gel, e rapidamente fazer o seu caminho para o outro lado do gel. Após uma certa quantidade de tempo, as moléculas de DNA tingidas podem ser vistas agregando-se em diferentes áreas do gel, com base em quão longe eles se moveram durante a eletroforese do gel. Isso permite aos pesquisadores identificar os segmentos, e comparar o DNA de diferentes organismos.para que é utilizado o electroforese em Gel?,
o objectivo da electroforese em gel é visualizar, identificar e distinguir moléculas que foram processadas por um método anterior, como a PCR, a digestão enzimática ou uma condição experimental. Muitas vezes, misturas de ácidos nucleicos ou proteínas que são coletadas de um experimento/método anterior são executados através de eletroforese em gel para determinar a identidade ou diferenciar entre moléculas.,
Gel de Eletroforese Passos
As grandes etapas envolvidas em um comum de DNA do gel de eletroforese protocolo:
Preparação das amostras para a execução de
O DNA é isolado e pré-processado (por exemplo, PCR, digestão enzimática) e composto em solução básica de corante azul para ajudar a visualizar o movimento da amostra através do gel.
prepara-se uma solução de gel de Tae de agarose
o tampão de TAE fornece uma fonte de iões para configurar o campo eléctrico durante a electroforese., A concentração peso-volume de agarose no tampão TAE é utilizada para preparar a solução. Por exemplo, se for necessário um gel de agarose a 1%, adiciona-se 1g de agarose a 100 ml de TAE. A percentagem de agarose utilizada é determinada pelo tamanho ou tamanho do ADN. Se se pretende separar um conjunto de bandas de ADN de tamanho menor (<500bp), é preparado um gel de agarose com maior percentagem (>1%). A maior percentagem de agarose cria um crivo mais denso para aumentar a separação de pequenas diferenças de comprimento do ADN., Aquece-se a solução de agarose-TAE para dissolver a agarose.a solução de Tae de agarose é vertida num tabuleiro de fundição que, uma vez que a solução de gel tenha arrefecido e solidificado, cria uma placa de gel com uma linha de poços no topo.o gel sólido é colocado numa câmara cheia de tampão de TAE. O gel é posicionado de modo que os poços da câmara estão mais próximos do eletrodo negativo da Câmara.,
carregar o gel
os poços da câmara de gel são carregados com as amostras de ADN e, normalmente, uma escada de ADN também é carregada como referência para tamanhos.
electroforese
os condutores negativos e positivos estão ligados à câmara e a uma fonte de alimentação onde a tensão está regulada. Ligando a fonte de alimentação configura o campo elétrico e as amostras de DNA carregadas negativamente vão começar a migrar através do gel e longe do eletrodo negativo para o positivo.,depois de o corante azul das amostras de ADN ter migrado através do gel suficientemente longe, a fonte de alimentação é desligada e o gel é removido e colocado numa solução de brometo de etídio. Intercalatos de brometo de etídio entre o ADN e é visível à luz UV. Por vezes, o brometo de etídio é adicionado directamente à solução de gel de agarose no Passo 2. O gel corado com brometo de etídio é então exposto à luz UV e é tirada uma fotografia. As bandas de ADN são visualizadas em cada faixa correspondente a um poço de câmara., A escada de DNA que foi carregada também é visualizada e o comprimento das bandas de DNA pode ser estimado. Um exemplo é dado na figura abaixo.
Tipos de Gel de Eletroforese
Existem dois tipos de gel de electroforese: nativo e desnaturação. A eletroforese do gel nativo geralmente tenta manter o RNA ou proteína em sua estrutura nativa, enquanto o corre através do gel., A electroforese em gel desnaturante tenta reduzir o ARN ou a proteína na sua estrutura mais linear antes ou durante a electroforese em gel.a desnaturação do ARN ou proteína é realizada adicionando um agente redutor à amostra, gel e/ou tampão. O agente redutor separa as ligações dentro da molécula de RNA ou proteína e, assim, reduz a sua estrutura secundária. A estrutura secundária de uma proteína ou RNA influenciará, de forma não linear, a rapidez com que migra através de um gel., Uma forma linear e desnaturada de RNA ou proteína, no entanto, migrará proporcionalmente ao seu tamanho linear (pares de base ou Kilo Daltons). A eletroforese gel desnaturante é muitas vezes mais precisa para a identificação do tamanho, enquanto que a eletroforese gel nativa é geralmente usada para identificar complexos proteicos maiores.
exemplos de electroforese em Gel
- a electroforese em Gel de Tae Agarose é mais frequentemente utilizada para o ADN.as páginas de desnaturação (electroforese em gel de poliacrilamida) são comuns para a separação do ARN.,
- SDS PAGE é uma eletroforese em gel de desnaturação comumente usada para identificação e separação de proteínas.