Citometria de fluxo vs. FACS: Qual é a diferença?citometria de fluxo e FACS (separação de células activadas por fluorescência) são procedimentos distintamente diferentes, embora FACS seja um procedimento descendente baseado em protocolos de citometria de fluxo. Avanços na tecnologia de triagem celular estão contribuindo de uma maneira grande para a paisagem da ciência molecular., As contribuições gerais do que é aprendido é o que guia o processo de descoberta farmacêutica, tanto na capacidade de diagnóstico como nos esforços terapêuticos, o que, por sua vez, leva a melhores resultados dos pacientes 1. o que é a citometria de fluxo?
citometria de fluxo é um método que é usado para examinar e determinar a expressão das moléculas intracelulares e da superfície celular e para definir e caracterizar diferentes tipos de células individuais. É também utilizado para determinar o volume celular, o tamanho da célula e avaliar a pureza das subpopulações que são isoladas., Isto permite a avaliação multi-parâmetros de células individuais ao mesmo tempo.a citometria de fluxo é um instrumento poderoso porque permite a análise simultânea de características físicas e químicas de até milhares de partículas por segundo. Isto o torna um método rápido e quantitativo para análise e purificação em suspensão celular. Usando o fluxo, podemos determinar o fenótipo e função e até mesmo separar células vivas., eu
Algumas das aplicações de medição retirado através de citometria de fluxo incluem:
- a função Plaquetária
- medula Óssea
- sangue Periférico
Os dois potencial de citometria de fluxo de dados de expressão formatos incluem:
- histogramas que medir ou comparar apenas um único parâmetro,
- ponto-enredos que comparar 2 ou 3 parâmetros simultaneamente em duas ou três dimensões scatter-plot. o que é o FACS?,
FACS é uma abreviatura para classificação de células únicas activadas por fluorescência, que é uma técnica de citometria de fluxo que adiciona ainda mais um grau de funcionalidade. Ao utilizar anticorpos altamente específicos rotulados com conjugados fluorescentes (uma molécula fluorescente chamada fluorocromo), a análise FACS nos permite coletar simultaneamente dados, e classificar uma amostra biológica por um número quase ilimitado de diferentes parâmetros. Tal como na citometria de fluxo convencional, são recolhidos dados de dispersão para a frente, dispersão lateral e sinal fluorescente.,através de um feixe de laser, as células ou outras partículas suspensas num fluxo líquido são atravessadas por um feixe de laser de forma simples e a interacção com a luz laser é medida por um aparelho electrónico de detecção de luz como a intensidade de dispersão da luz e de fluorescência. Se um marcador fluorescente estiver ligado a um componente celular, a intensidade de fluorescência representará idealmente a quantidade desse componente em particular.
a triagem celular através de instrumentação avançada de triagem celular é realizada com alta especificidade e altos padrões., Pesquisadores gostam de usar os métodos de citometria de fluxo porque é a maneira mais rápida e eficaz de aplicar a medição a todo o processo celular. O operador predetermina ou seleciona determinados parâmetros sobre como as células devem ser ordenadas. i
neste ponto, a máquina de triagem celular impõe uma carga elétrica em cada célula de modo que as células serão classificadas por carga (usando eletroímanes) em vasos separados ao sair da câmara de fluxo. A tecnologia para classificar fisicamente uma mistura heterogênea de células em diferentes populações é útil para muitas aplicações terapêuticas e clínicas.,
compreendendo a relação entre FACS e Citometria de fluxo
para colocar a relação entre análise FACS e citometria de fluxo em contexto simples, eles são basicamente parceiros no processo de análise celular. FACS é usado como um classificador de células e enriquecido para um subconjunto de células que é frequentemente estudado em mais detalhes usando citometria de fluxo ou outras técnicas analíticas 2. citometria de fluxo
é usada para análise celular e é focada na medição da expressão proteica ou co-expressão dentro de uma população mista de células., Tanto a citometria de fluxo como as FACS são desenvolvidas para diferenciar as células de acordo com os seus filtros ópticos.
a distinção chave entre as duas modalidades de caracterização celular está na funcionalidade do método sendo utilizado. tanto a citometria de fluxo como as FACS tendem a ser utilizadas indistintamente. Ambos são desenvolvidos para diferenciar células de acordo com suas propriedades ópticas. No entanto, existem algumas diferenças na metodologia que são distintas e têm diferentes resultados processuais., Usado singularmente os resultados são unilaterais, e usados em conjunto, os resultados são dados de expressão de múltiplos Parametros celulares 3.
–FACS é um processo através do qual uma mistura de amostras de células é separada, de acordo com as suas características de dispersão da luz e de fluorescência, em dois ou mais recipientes.
–citometria de Fluxo é uma metodologia que é utilizada durante a análise de uma população heterogênea de células de acordo com as diferentes moléculas de superfície celular, tamanho e volume, o que permite a investigação de células individuais.,
-FACS, juntamente com a citometria de fluxo pode medir e caracterizar os vários célula gerações usando altamente anticorpos específicos marcados com corantes fluorescentes, um pesquisador pode realizar FACS análise e, simultaneamente, recolher dados de expressão e classificar amostras de células por um número de variáveis.
Como a citometria de fluxo e as FACS são utilizadas em aplicações clínicas
imunofenotipagem: um dos formatos de aplicação mais comuns utilizados é a imunofenotipagem. Esta é uma metodologia que identifica e quantifica várias populações de células em uma amostra heterogênea., Isto inclui sangue periférico, medula óssea e material linfático. A imunofenotipagem é utilizada principalmente em contextos hematológicos para diagnosticar certos cancros, ou seja, linfoma maligno e/ou leucemia4.selecção de células: os avanços nos separadores de células são orientados para o isolamento suave das células em tubos separados. Medidores de vazão especializados com a capacidade de interrogar e caracterizar cada célula ao passar pelo laser e expressar dados de medição cruciais da célula., A chave aqui também é medida em um sentido quantitativo – a instrumentação é capaz de lidar com grandes volumes que tornam o exame microscópico obsoleto. análise do ciclo celular: com citometria de fluxo e FACS, a célula pode ser analisada e medida em todas as quatro fases distintas de todo o ciclo celular. Os testes baseados em células podem então ajudar na determinação de anomalias celulares usando certos corantes fluorescentes. O campo da Genómica de células únicas utiliza ambos estes métodos para estudar um único tipo de célula para uma população de células.,apoptose: apoptose, ou morte celular programada, é uma parte normal do ciclo de vida das células eucarióticas. As células morrem por uma variedade de razões: por necrose, provocada por mudanças físicas e químicas externas à célula ou por apoptose, um processo no qual as células iniciam um programa de “suicídio” através de fatores internamente controlados. Estes dois tipos distintos de morte celular, apoptose e necrose, podem ser identificados através da metodologia citométrica de fluxo e usados para determinar mudanças morfológicas, bioquímicas e moleculares que ocorrem em células moribundas.,ensaios de proliferação celular: ensaios baseados em células são uma das ferramentas-chave para medir as respostas do mecanismo de acção a certos estímulos, tais como factores de crescimento, citocinas e outros componentes de meios de comunicação. O Citómetro de fluxo pode medir a proliferação rotulando células em repouso com um corante fluorescente de membrana celular, éster succinimidílico de carboxilluoresceína (CFSE). Quando as células são ativadas, elas começam a proliferar e passam por mitose. À medida que as células se dividem, metade do corante original é passado para cada célula filha., Ao medir a redução do sinal de fluorescência, os pesquisadores podem calcular a ativação celular e proliferação.fluxo intracelular de cálcio: as células interagem no seu ambiente através das vias de transdução do sinal. Quando estas vias são activadas, os canais iónicos de cálcio ligados à membrana bombeiam cálcio para a célula e aumentam rapidamente a concentração intracelular de cálcio. Os níveis mais elevados de cálcio fornecem à célula energia para responder. O Citómetro de fluxo é capaz de detectar o fluxo de cálcio para a célula e fornecer dados de medição detalhados5.,
encerrando
A expansão das técnicas citométricas de fluxo para avaliar as características intracelulares está a mover esta plataforma para a arena de determinação da função celular. Estas abordagens mais recentes estão expandindo a utilidade da citometria de fluxo como uma ferramenta valiosa para uma compreensão mais profunda da função imunitária e do papel de certas células como ele começa a revelar indicadores de apoptose., Ao melhorar a viabilidade das chamadas através da melhoria da tecnologia e reconhecendo a morte celular ou apoptose, a tecnologia serve para ajudar os pesquisadores a entender por que isso acontece e as mudanças bioquímicas que ocorrem específicas a cada fase da atividade celular. Mapear as vias do sinal e a fragmentação do ADN é uma técnica que os geneticistas moleculares estão a achar muito valiosa. as soluções terapêuticas baseadas em ARNm parecem ser fundamentais para resolver alguns dos enigmas associados a doenças sistémicas 6., à medida que nos aproximamos de ser capazes de explorar o processo analítico celular através da tecnologia 3D, é fácil ver como o conhecimento adquirido levará a uma maior inovação. A comunidade de investigação está ansiosa por alargar o manto da ciência molecular para incluir a tecnologia das células estaminais. Com as células estaminais e a capacidade de cloná-las eficazmente e apresentá-las ao corpo para criar mudança de sistema é para onde o futuro está indo., Podemos ver como a citometria de fluxo e a metodologia diferente das FACS eventualmente resultarão em resultados mais positivos para o paciente, intervenções terapêuticas, e talvez um dia completa lise de tumores cancerosos. A doença genética está rapidamente a ser descoberta e a exposição de muitas novas descobertas iniciou um novo movimento de ciência biológica e molecular (7).
fontes:
2https: / / www.sciencedirect.,com/science/article/abs/pii/0022175981902532
3 https://sciencing.com/understand-flow-cytometry-results-5805206.html
4 https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/immunophenotyping
5 https://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1087057104264038
6 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4623474/
7 https://www.nature.com/scitable/topicpage/cdk-14046166/