materiałowi towarzyszy prezentacja na temat struktury białka i zasad denaturacji próbek i nieciągłej elektroforezy żelowej.
rozdzielenie makrocząsteczek w polu elektrycznym nazywa się elektroforezą. Bardzo popularna metoda oddzielania białek za pomocą elektroforezy wykorzystuje nieciągły żel poliakrylamidowy jako nośnik i siarczan dodecylu sodu (SDS) do denaturowania białek. Metoda ta nazywa się elektroforezą żelową poliakrylamidową siarczanu dodecylu sodu (SDS-PAGE)., Najczęściej używany system jest również nazywany metodą Laemmli po U. K. Laemmli, który jako pierwszy opublikował pracę wykorzystującą SDS-PAGE w badaniu naukowym.
SDS (zwany także siarczanem laurylowym) jest anionowym detergentem, co oznacza, że po rozpuszczeniu jego cząsteczki mają ujemny ładunek netto w szerokim zakresie pH. Łańcuch polipeptydowy wiąże ilości SDS proporcjonalnie do jego względnej masy cząsteczkowej. Ujemne ładunki na SDS niszczą większość złożonej struktury białek i są silnie przyciągane w kierunku anody (dodatnio naładowanej elektrody) w polu elektrycznym.,
żele Poliakrylamidowe powstrzymują większe cząsteczki przed migrowaniem tak szybko, jak mniejsze cząsteczki. Ponieważ stosunek ładunku do masy jest prawie taki sam wśród SDS-denaturowanych polipeptydów, ostateczna separacja białek jest zależna prawie całkowicie od różnic w względnej masie cząsteczkowej polipeptydów. W żelu o jednolitej gęstości względna odległość migracji białka (Rf, f jako indeks dolny) jest ujemnie proporcjonalna do logu jego masy., Jeśli białka o znanej masie są uruchamiane jednocześnie z niewiadomymi, można wykreślić zależność między Rf i masą, a masy nieznanych białek oszacować.
separacja białek przez SDS-PAGE może być wykorzystana do oszacowania względnej masy cząsteczkowej, określenia względnej obfitości głównych białek w próbce i określenia rozkładu białek między frakcjami. Czystość próbek białka można ocenić i postęp procedury frakcjonowania lub oczyszczania można śledzić., Różne metody barwienia mogą być stosowane do wykrywania rzadkich białek i dowiedzieć się czegoś o ich właściwościach biochemicznych. Wyspecjalizowane techniki, takie jak Western blotting, dwuwymiarowa elektroforeza i peptyd mapowanie mogą używać wykrywać bardzo skąpe geny produkty, znajdować podobieństwa między nimi, i wykrywać i oddzielać izoenzymes proteiny.
Masa cząsteczkowa a masa cząsteczkowa
Masa cząsteczkowa (symbol m) wyrażona jest w Daltonach (Da). Jeden Dalton jest zdefiniowany jako 1/12 masy węgla 12., Większość makrocząsteczek jest wystarczająco duża, aby użyć kilodaltona (kDa) do opisu masy cząsteczkowej. Masa cząsteczkowa nie jest taka sama jak masa cząsteczkowa. Jest również znany jako względna Masa cząsteczkowa (symbol Mr, gdzie r jest indeksem dolnym). Masa cząsteczkowa jest zdefiniowana jako stosunek masy makrocząsteczki do 1/12 masy atomu węgla 12. Jest to wielkość bezwymiarowa.
Gdy w literaturze podaje się masę w Da lub kDa, odnosi się to do masy cząsteczkowej. Nieprawidłowe jest wyrażanie masy cząsteczkowej (względnej masy cząsteczkowej) W Daltonach., Niemniej jednak można znaleźć termin Masa cząsteczkowa używany z Daltonów lub kilodaltonów w niektórych literaturze, często używając skrótu MW dla masy cząsteczkowej.
żele Poliakrylamidowe do SDS-PAGE
opracowano wiele systemów do elektroforezy białek, a Aparatura używana do SDS-PAGE jest bardzo zróżnicowana. Metodologia zastosowana na tych stronach wykorzystuje metodę Laemmli. Odniesienie do metody Laemmli w sekcji Materiały i metody eliminuje konieczność opisywania buforów, odlewów żeli, aparatów itp., O ile w artykule nie zastosowano modyfikacji metody, jedynymi szczegółami strony SDS, które należy podać w sekcji metody, są procent całkowity akrylamidu (%T) w żelu, względny procent i rodzaj sieciowania (%C), a być może odniesienie do wymiarów żelu. Używamy systemu „mini-gel”, z 3 kasetami żelowymi 1/4 „x 4”.
SDS-PAGE można przeprowadzić na żelach wstępnie odlewanych, oszczędzając kłopoty i ryzyko związane z pracą z akrylamidem. Poniższy opis odnosi się do aparatury odlewniczej i biegowej produkowanej przez sklep, która jest znacznie tańsza niż sprzęt dostępny na rynku., Oprócz opłacalności, zaletą tworzenia własnych żeli za pierwszym razem jest głębsze zrozumienie procesu.
niezależnie od systemu, przygotowanie wymaga odlewania dwóch różnych warstw akrylamidu między płytami szklanymi. Dolna warstwa (oddzielająca lub rozdzielająca, żel) jest odpowiedzialna za rzeczywiste oddzielenie polipeptydów według wielkości. Górna warstwa (żel do układania) obejmuje studnie próbne. Jest przeznaczony do zamiatania białek w próbce między dwoma ruchomymi granicami, tak że są one skompresowane (ułożone w stos) w mikrometryczne cienkie warstwy, gdy docierają do żelu oddzielającego.,