etiologiczna diagnostyka zakażeń pneumokokowych
pneumokoki są główną przyczyną zapalenia płuc i ważną przyczyną zapalenia opon mózgowych, bakteriemii, posocznicy, zapalenia ucha środkowego, nieżytu nosa i zapalenia zatok . Klasycznie diagnoza etiologiczna tych zakażeń została przeprowadzona przez wyhodowanie mikroorganizmu z odpowiednich próbek pacjenta.,
Identyfikacja Streptococcus pneumoniae z hodowli zależy od obserwacji cech morfologicznych zarówno bakterii, jak i Kolonii, a także od trzech innych głównych cech fenotypowych, w tym negatywności katalazy, rozpuszczalności żółci i podatności na optochiny. Podatność na optochin jest podstawą do identyfikacji pneumokoków ze względu na łatwość wykonania testu, którego podstawą jest hamowanie ATPazy pneumokokowej przez optochin, cecha, która nie jest ogólnie wspólna dla innych paciorkowców viridians ., Jednak pojawienie się wariantów opornych na optochinę podważyło Ważność stosowania tego jedynego testu do przypuszczalnej identyfikacji pneumokoków. Specyficzność testu rozpuszczalności żółci pozostaje wysoka i jest to najdokładniejszy pojedynczy test do identyfikacji S. pneumoniae . Fenotyp rozpuszczalności w żółci wynika z aktywacji głównego enzymu autolitycznego (amidazy N-acetylomuramylo-l-alaniny kodowanej przez gen lytA), który może być również osiągnięty przez dezoksycholan sodu., Stwierdzono, że kilka izolatów pneumokoków jest nierozpuszczalnych w dezoksycholanie sodu, co przypisano zmianom w głównej autolizynie, ale przeważająca większość pneumokoków pozostaje rozpuszczalna w żółci, co czyni ją niezwykle dokładnym testem identyfikacji pneumokoków.
Matrix-assisted laser desorption jonization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF) przynosi fundamentalną zmianę w rutynowej identyfikacji drobnoustrojowych patogenów w klinicznych laboratoriach mikrobiologicznych ., Pomimo sukcesu MALDI-TOF w usprawnianiu i zapewnianiu konsekwentnie dokładnej identyfikacji, nawet z wcześniej problematycznymi organizmami, sukces obecnie dostępnych systemów w identyfikacji S. pneumoniae był słaby . Profil masowy systemów MALDI-TOF stosowanych w laboratoriach mikrobiologii klinicznej jest generowany głównie przez białka rybosomalne ułatwiające dostosowanie do obecnych klasyfikacji taksonomicznych. Jednak S., pneumoniae jest kladem w obrębie ewolucyjnie pokrewnej grupy paciorkowców, z którą może mieć wiele cech, w tym podobne białka rybosomalne . Dlatego rozróżnienie przez MALDI-TOF między S. pneumoniae a jego mniej patogennymi krewnymi grupy mitis jest trudne. Ostatnio argumentowano, że dokonanie tego rozróżnienia może być możliwe przy użyciu bardziej szczegółowej analizy profili masy, a następnie opublikowano publikację informującą o sukcesie dostępnego na rynku systemu w odróżnianiu S. pneumoniae od innych gatunków z grupy mitis ., Te zachęcające zmiany mogą doprowadzić do uproszczenia rutynowej identyfikacji S. pneumoniae w klinicznych laboratoriach mikrobiologicznych.
zdolność do wytwarzania polisacharydu otoczkowego (CPS) jest również cechą charakterystyczną pneumokoków. Kapsuła może być wizualizowana przez kilka mikroskopowych technik, ale w pneumococci obecność CPS zazwyczaj wykrywa przy użyciu specyficznych surowic . Instytut Serum Statens w Kopenhadze, Dania, jest najczęstszym źródłem surowic do identyfikacji kapsułek pneumokokowych., Dostarczają one „omni-surowicę”, która reaguje ze wszystkimi znanymi kapsułkami pneumokokowymi i która może być przydatna w identyfikacji pneumokoków, a także specyficzne surowice, które reagują tylko z określonymi polisacharydami lub grupami polisacharydów . Znane są przypadki nieencyklopedycznych pneumokoków, które często są związane z ogniskami zapalenia spojówek . Ponieważ jednak produkcja CPS jest tak definiującą cechą pneumokoków, zostały one poddane szczególnie rygorystycznym testom w celu potwierdzenia ich identyfikacji jako S. pneumoniae .,
identyfikacja pneumokoków CPS za pomocą efektu Quellunga lub testu Neufelda, przy użyciu specyficznych surowic króliczych, jest sprawdzoną techniką stosowaną od wczesnych dni serotypowania pneumokoków . Technika ta wymaga jednak specjalistycznej wiedzy, dlatego niedawno Instytut Serum Statens udostępnił test aglutynacji lateksowej, który pozwala na bardziej usprawnioną procedurę określania serotypu pneumokoków . Aby jeszcze bardziej uprościć ten proces, opracowano kilka schematów „serotypowania genetycznego” w celu identyfikacji szczególnych cech loci cps., Pomimo mnogości podejść, te szerzej przyjęte są oparte na amplifikacji PCR specyficznych serotypów lub genów serotypowych . W rzeczywistości opracowano zarówno konwencjonalne, jak i procedury PCR w czasie rzeczywistym, a także zaproponowano wiele różnych systemów uwzględniających różnice w częstości występowania różnych serotypów w różnych regionach geograficznych ., Chociaż serotypowanie genetyczne sprawiło, że serotypowanie dostępne dla większej liczby laboratoriów i pomogło wyjaśnić niejasne reakcje, metody fenotypowe pozostają złotym standardem dla serotypowania pneumokoków, i odzwierciedlając to, Hybrydowe podejścia obejmujące zarówno PCR, jak i przeciwciała monoklonalne zostały również opracowane ., Być może najbardziej klarownymi tego przykładami są Izolaty, w których locus otoczkowy zawiera mutacje punktowe lub wstawki prowadzące do braku ekspresji CPS (van der Linden i Ramirez, niepublikowane dane), ale które byłyby przypisane serotypu zgodnie z genetycznymi schematami serotypowania.
nowsze metody polegające na wykrywaniu składników drobnoustrojów stają się coraz ważniejsze w diagnostyce zakażeń pneumokokowych ., Immunochromatograficzne wykrywanie polisacharydu C (kwasu teichoic) w moczu znacznie poprawiło diagnozę pneumokokowego zapalenia płuc u dorosłych, chociaż u dzieci wysoka częstotliwość przenoszenia pneumokoków skutkuje niewystarczającą swoistością testu . Test jest również walidowany do stosowania w płynie mózgowo-rdzeniowym, co prowadzi do zwiększonej diagnostyki etiologicznej zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych ., Istnieje coraz więcej dowodów na przydatność testu w wykrywaniu pneumokoków w płynie opłucnowym u dzieci i dorosłych , ale jest znacznie mniej informacji na temat jego stosowania w płukaniu oskrzelowo-płucnym , w aspiratach nosowo-gardłowych lub w pożywkach do hodowli krwi , gdzie może on być przydatny w wykrywaniu pneumokoków, które nie są już żywotne.
Ostatnio do diagnostyki wykorzystywano wykrywanie DNA pneumokoków. W tym celu wykorzystano amplifikację przez PCR fragmentów genów specyficznych dla S. pneumoniae, takich jak lytA, ply, psaA, cpsA (wzg), czy spn9802., Metody PCR w czasie rzeczywistym okazały się bardziej wrażliwe niż konwencjonalne PCR, ale inne odmiany, w tym wykrywanie produktów PCR z kulkami, mikroarrays, lub frakcjonowanie rozmiar zostały również opracowane . Połączenie amplifikacji DNA do identyfikacji z omówionymi powyżej podejściami serotypowania genetycznego pozwala na identyfikację serotypu szczepu bez konieczności hodowli . Zastosowanie tych metod w wysięku parapneumonicznym lub rozedmie płuc jest dobrze udokumentowane i znacznie zwiększa wydajność diagnostyki etiologicznej nad kulturą .,
istnieje duże zainteresowanie zastosowaniem tych metod wykrywania pneumokoków we krwi w przypadkach zapalenia płuc zarówno u dzieci, jak i dorosłych . Jednak wysoki współczynnik przenoszenia pneumokoków u dzieci może być ważnym czynnikiem zakłócającym poprzez wykrywanie krążenia DNA pneumokoków u zdrowych nosicieli . Dwa badania konkretnie dotyczyły tej kwestii, z sprzecznymi wynikami . Inne badania wskazują, że szacowane obciążenie pneumokokami we krwi jest skorelowane z ciężkością choroby i może być potencjalnie wykorzystane do rozróżnienia między kolonizacją a zakażeniem .,
podobne podejście zalecono w przypadku okazów oddechowych, które są częściej dostępne, takich jak plwocina. Wartość plwociny w diagnostyce zapalenia płuc została obszernie omówiona , nawet w kontekście konwencjonalnych metod hodowli. Chociaż można twierdzić, że brak pneumokoków może potencjalnie wykluczyć go jako czynnik etiologiczny, hipoteza, która z pewnością uzasadnia dalsze badania, jego wykrycie może być przypisane do zakażenia lub bezobjawowego przewozu ., U dorosłych, quantification pneumococci lub pneumokokowego DNA w plwocinie zaproponowano odróżnić kolonizacji i choroby, ale może to być skomplikowane ze względu na zmienność testów i brak jasnych kryteriów definiowania wartości odcięcia, nawet w dobrej jakości próbek . U dzieci sugerowano podobne podejścia, ale wartość diagnostyczna tego podejścia jest dodatkowo kwestionowana przez fakt, że wiele dzieci jest skolonizowanych przez pneumokoki przy bardzo wysokiej gęstości., Monitorowanie dwóch kluczowych markerów gospodarza, białka C-reaktywnego i prokalcytoniny, wydaje się zwiększać specyficzność testów PCR w diagnostyce zakażeń pneumokokowych dolnych dróg oddechowych . Pomimo tych niepewności, kilka dostępnych na rynku testów oferuje już wykrywanie pneumokokowego DNA do celów diagnostycznych .,
chociaż tradycyjne Metody mikrobiologiczne, w tym nowsze metody wykrywania antygenów, pozostaną podstawą w wielu laboratoriach diagnostyki zakażeń pneumokokowych, nowsze metody molekularne bez wątpienia staną się coraz ważniejsze. Zwiększone przyjęcie testów molekularnych będzie zależeć od wyjaśnienia znaczenia dla identyfikacji zakażenia wykrywania dowodów obecności produktów bakteryjnych w próbkach ludzkich. Będzie to szczególnie skomplikowane w przypadku okazów układu oddechowego, gdzie trwa debata, nawet w przypadku bardziej tradycyjnych podejść., Biorąc pod uwagę nasze rosnące zrozumienie zależności między wieloma patogenami w górnych drogach oddechowych, które mogą warunkować ich zdolność do wywoływania infekcji, podejścia molekularne, które wykrywają wiele patogenów bez wątpienia staną się coraz ważniejsze w diagnostyce etiologicznej zakażeń dróg oddechowych .