A Identyfikacja elementów IS w E. coli
elementy IS zostały po raz pierwszy wykryte przez efekty wywołane, jeśli elementy te są zintegrowane z lac (Malamy, 1966, 1970) i operonów gal (Saedler and Starlinger, 1967a, b; Jordan et al., 1967; Adhya i Shapiro, 1969) E. coli i do wczesnego, prawostronnego Operonu jego bakteriofaga lambda (Brachet et al., 1970)., Pierwiastki powodują zerową mutację genu, w który się integrują i bardzo silny polarny wpływ na wszystkie geny Operonu zlokalizowane dystalnie do zmutowanego genu. Mutacje powracają spontanicznie do typu dzikiego, ale częstość ich występowania nie może być zwiększona przez mutageny. Wzbudziło to podejrzenie, że mutacje nie były mutacjami punktowymi, lecz rearanżacjami DNA.,
można było wykazać, że mutacja dodała DNA do Operonu gal, porównując gęstość transdukujących bakterii lambda dgal, które nie nosiły lub nie nosiły mutacji i były inaczej izogeniczne (Jordan et al., 1968; Shapiro, 1969). Wykluczyło to możliwość, że mutacje były spowodowane inwersją DNA. Aby odróżnić dwie pozostałe możliwości, powielanie części gal operon lub wstawianie do tego OPERON niepowiązanego DNA, Michaelis et al., (1969) porównywał zmutowanego i niemutowanego DNA poprzez hybrydyzację RNA transkrybowanego z mutanta do DNA. Eksperymenty te wyraźnie wykazały, że dodatkowe DNA Znalezione w mutantach nie pochodzi z gal operon. Ponadto można było wykazać, że dodatkowe DNA u dwóch niezależnych mutantów dzieliło przynajmniej niektóre z tych sekwencji. Wywołało to możliwość, że mutanty nie były spowodowane przez wstawienie przypadkowych segmentów DNA E. coli, ale raczej przez transpozycję określonych transpozytywnych elementów.,
ta hipoteza okazała się prawdziwa, gdy większa liczba mutantów była badana przez wstawienie heteroduplex cząsteczek DNA w mikroskopie elektronowym (Fiandt et al., 1972; Hirsch et al., 1972a, b; Malamy et al., 1972). W tym czasie można było zidentyfikować cztery różne elementy. Były one nazywane sekwencjami wstawiania (IS) i ponumerowane kolejno od IS1 do IS4. IS1 ma długość około 0,8 Kb (kilobazy). Pozostałe elementy mają długość około 1,5 Kb. Piąty element, IS5, o podobnej wielkości (Blattner et al.,, 1974) i większy pierwiastek nieco ponad 5 Kb, który ze względów historycznych nazywa się γ-δ(Guyer, 1978), zostały wykryte od tego czasu, ale liczba wydaje się być bliska nasycenia dla E. coli K12.
w obrębie mikroskopu elektronowego poszczególne elementy IS Nie dzielą sekwencji, natomiast poszczególne Izolaty tego samego pierwiastka są identyczne. Oczywiście nie wyklucza to niewielkich różnic w sekwencji między tymi ostatnimi.,
hybrydyzacja odpowiednich pojedynczych nici DNA dzielących tylko element IS w formie komplementarnej, a następnie trawienie z nukleazami specyficznymi dla pojedynczej nici pozwala na izolację DNA IS w czystej postaci (Ohtsubo and Ohtsubo, 1976; Schmidt et al., 1976). Szybki rozwój analizy ograniczeń DNA i metod sekwencjonowania pozwoliły rzeczywiście określić pełną sekwencję IS1 (Ohtsubo and Ohtsubo, 1978; Johnsrud, 1979)i IS2 (Ghosal et al., 1979a). Sekwencja IS4 jest bliska ukończenia w momencie pisania tego rozdziału (R. Klaer et al., niepublikowane eksperymenty).,
DNA–techniki hybrydyzacji DNA zostały zastosowane do poszukiwania obecności elementów IS w chromosomie E. coli. IS1 i IS2 występują odpowiednio w ∼8 i ∼5 egzemplarzach (Saedler i Heiss, 1973). Zastosowanie techniki blotting Southern pozwoliło na dokładne określenie liczby kopii IS3 w E. coli K12 i IS4 . Ponadto, niektóre z elementów IS wykazano być przenoszone na E. coli płodności plasmid F (Davison et al., 1975a), a także na niektórych czynnikach R (Hu et al., 1975).,
elementy IS nie są znane z kodowania genów, które są tłumaczone na białka, choć w przypadku IS1 znana sekwencja DNA nie wyklucza możliwości translacji do (kilku) peptydów o ograniczonych rozmiarach. Długość elementów IS wyklucza powstawanie dużych białek. Znane efekty elementów IS są zatem ograniczone do pozycji, w której są zintegrowane, oraz do sąsiednich sekwencji DNA w pozycji cis. Efekty te zostały opisane w poniższych sekcjach.
kolejna klasa transpozytywnych elementów DNA została opisana od 1974 roku., Nazywane są transpozonami. Z reguły są one większe niż elementy IS i są wykrywane przez efekty, które są spowodowane przez białko kodowane w DNA transpozonu. Pierwsze transpozony opisane kodują oporność na antybiotyki, a większość znanych transpozonów nosi geny oporności (Datta et al., 1971; Hedges and Jacob, 1974; po recenzje patrz Cohen, 1976; Kleckner, 1977). Istnieją jednak transpozony, które kodują enterotoksynę E. coli (So et al., 1979), czy geny fermentacji laktozy (Cornells et al., 1979)., Tn3, oprócz przenoszenia genu dla β-laktamazy, przenosi również geny zaangażowane w proces transpozycji (Heffron et al., 1977; Gill et al., 1978; Chou et al., 1979). To samo wydaje się być prawdziwe dla Tn5 (Berg et al., 1978).
transpozony występują w przyrodzie jako części plazmidów. Transpozycja pomiędzy plazmidami wyjaśnia zmienność stwierdzoną w odniesieniu do wielokrotnej lekooporności różnych plazmidów. W laboratorium wykryto transpozycję do genomu bakteriofagów oraz transpozycję do chromosomu bakteryjnego., Żaden ze znanych transpozonów nie jest jednak naturalnym składnikiem chromosomu E. coli K12.
literatura na temat transpozonów szybko się rozwija, a dla opisu wielu różnych transpozonów znanych w momencie pisania tego artykułu, czytelnik odsyła do bardziej wyczerpujących recenzji na ten temat.
wszystkie badane do tej pory transpozony mają wspólną strukturę: przenoszą powtarzającą się sekwencję DNA na końcach oraz unikalne geny kodujące DNA pomiędzy tymi powtarzającymi się sekwencjami DNA. W większości przypadków powtarzające się sekwencje DNA są odwrócone względem siebie., Ich wielkość jest zmienna. W niektórych transpozonach odwrócone powtórzenia są około 1,5 Kb i istnieje powód, aby podejrzewać, że sekwencje te są niezależnie transponowalne elementy IS. W innych przypadkach powtarzające się DNA jest tylko około 0,15 Kb (np Tn1–3, kodowanie oporności ampicyliny (Heffron et al., 1975; Kopecka i Cohen, 1975).
W przypadku Tn9, kodowanie oporności na chloramfenikol (McHattie and Jackowski, 1977) i Tn1681, kodowanie enterotoksyny E. coli (So et al., 1979), Sekwencja powtarzana na końcu to IS1., W tym drugim przypadku dwie kopie IS1 są odwrócone względem siebie, podczas gdy w pierwszym przypadku dwie kopie IS1 są bezpośrednimi powtórzeniami. Jak wiadomo z sekwencji DNA IS1, że sam ten element jest zakończony małymi niedopasowanymi powtórzeniami DNA, ogólna zasada, że sam koniec transpozonów jest odwróconym powtórzeniem, jest zachowana nawet dla Tn9. Rzeczywiście, w przypadku IS2 (Ghosal et al., 1979a) i IS4 (Habermann et al., 1979), odwrócone powtórzenia znajdują się na ich końcach., Ogólność tej obserwacji może nawet wiązać się z rolą tych odwróconych powtórzeń w procesie transpozycji.