eksperymentalna weryfikacja modeli
w pierwszym podejściu (3) zidentyfikowano pierwotne miejsca inicjacji w 14 białkach, w tym w rnazie a trzustki bydlęcej i mioglobinie kaszalota, a także inne mniej stabilne miejsca inicjacji (11) W Rnazie A. pierwotne miejsce inicjacji dla RNazy A zidentyfikowano w tym modelu jako pozostałości 106-118. Zastosowanie drugiego podejścia (8)do RNase A (13) doprowadziło do sześciu miejsc (zilustrowanych na Rys., 3 a), które były zgodne z tymi określonymi (11) w pierwszym podejściu (3). Są to pozostałości 4-11 (region A), pozostałości 25-34 (region B), pozostałości 51-57 (region C) oraz struktury przeciwporównawcze (niekoniecznie plisowane arkusze) powstałe w wyniku połączenia pozostałości 53-67 z pozostałościami 69-79 (region D), pozostałości 71-90 z pozostałościami 91-111 (region E) oraz pozostałości 103-111 z pozostałościami 115-124 (region F). Kolejne etapy na ścieżce fałdowania polegają na wzroście lub koalescencji tych regionów. Region G powstaje, gdy pozostałości 36-48 razy przeciw helisie B., Region G zawiera jednak kontakty o większym zasięgu niż helisa B. dlatego uważa się, że G tworzy się na późniejszym etapie niż B. Region L tworzy się przez skojarzenie regionu a z B, G i C. Po tej sekwencji strukturalnej następuje region H, utworzony, gdy regiony C i D stykają się; przez region K zawierający kontakty między regionami E I F; przez region J, w którym regiony C I D tworzą kontakty z regionami E I F; oraz przez region i zawierający kontakty regionów E I H z G. wreszcie, region M powstaje, gdy region A styka się z E i F.,
przewidywane pierwotne miejsce składania inicjacji RNazy A jest zgodne z obserwowaną kolejnością w resztach 113 i 114 w macierzystej cząsteczce, z bardzo wysokim stopniem zachowania niepolarnych pozostałości w miejscu 106-118 23 gatunków ssaków tego białka (3) oraz z eksperymentalnymi informacjami na temat półproduktów wykrytych podczas termicznego rozkładania się RNazy A (14)., NMR dowody na lokalną strukturę w rozwiniętej Rnazie A w Warunkach fałdowania (15) i w jej fragmentach (16) oraz badania immunochemiczne nad tworzeniem stabilnych miejsc antygenowych (na powierzchni białka, pokrywających Zakopane pierwotne hydrofobowe miejsce inicjacji, gdy zredukowana Rnaza A jest utleniona (ref. 17 i rys. 8 ref. 18), były również zgodne z tym obrazem. Inne eksperymentalne dowody potwierdzające istnienie miejsc inicjacji A-F przedstawiono w ref. 11.,
dla apomioglobiny w pierwszym podejściu (3) zidentyfikowano pierwotne miejsce inicjacji fałdu jako pozostałości 103-115, które obejmują główną część helisy G, z sekwencją Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-Ile-his-Val-Leu., Zastosowanie drugiego podejścia (8) i obliczeń konformacyjno-energetycznych doprowadziło do sugestii, że interakcje między helisami A, G I H apomioglobiny mogą być ważne dla inicjacji składania (19), zgodnie z wynikami eksperymentalnymi, które uwzględniały te regiony w pośrednich równowagach apomioglobiny (20) oraz w najwcześniejszych krokach kinetycznych w ścieżce składania (21). Ostatnie badania eksperymentalne mutantów mioglobiny (22, 23) zapewniają przekonujące wsparcie dla modeli, które zawierają inicjację hydrofobową i propagację fałdowania.,
Apomioglobina stała się paradygmatem badań nad ścieżkami fałdowania (24). Część cząsteczki apomioglobiny, składająca się z helisy A, G I H oraz część helisy B, szybko się składa, tworząc na szlaku pośrednim, z resztą łańcucha polipeptydowego składającą się w wolniejszym tempie, rzędu sekund (21, 25). Fragmenty peptydowe apomioglobiny odpowiadające helisom G I H wykazywały skłonność do budowy helisy( 26-28), podczas gdy peptydy odpowiadające pozostałej części białka wykazywały znacznie mniejszą skłonność do tworzenia helisy (29)., Jednak eksperyment, w którym helisa H mioglobiny została zmutowana w celu zmniejszenia jej skłonności do spirali (30), wykazał bardzo niewielki wpływ na szybkość składania białka. Znacznie większy efekt zaobserwowano, gdy histydyna dystalna (H64) została zmieniona na fenyloalaninę: zastąpienie niepolarnego łańcucha bocznego zakopanej histydyny polarnej spowodowało znaczny wzrost szybkości składania (31). Badania te wskazywały na znaczenie pakowania łańcuchem bocznym, szczególnie w powierzchniach kontaktowych Helis, dla szybkości składania apomioglobiny.,
Apomioglobina ma tę zaletę, że może być badana w równowadze w wielu warunkach roztworu, które przybliżają niektóre z obserwowalnych etapów na kinetycznej ścieżce składania. W ten sposób możliwe było określenie skłonności konformacyjnych rozkładanej i częściowo złożonej apomioglobiny przez NMR (32-35). Co ciekawe, rozwinięta kwasowo apomioglobina wykazuje skłonność do nie-rodzimej struktury helicznej w regionie, który łączy helisy D I E, jak również natywną strukturę obserwowaną w helisach a i H, co zostało przewidziane w badaniach kinetycznych (34)., Badania NMR dotyczące skłonności konformacyjnych różnych form apomioglobiny (32-35) obejmowały wyznaczenie parametrów relaksacyjnych łańcucha polipeptydowego do specyficznego określenia dynamiki szkieletu w każdym ze Stanów białka. Zamiast analizy” bez modelu”, która jest odpowiednia dla złożonych białek, dane relaksacyjne zostały przeanalizowane przez obliczenie zredukowanych funkcji gęstości widmowej J(0), j(wN) i j(Wh) (36). Funkcja J (0) informuje o ruchach skali czasowej µs–ms i sugeruje, że dla apomioglobiny przy pH 2.,3, helisy A I G nawiązywały kontakty przejściowe (34). Ten ekscytujący wynik, później potwierdzony przez badania NMR z etykietą spinową (37), dostarczył ostatecznych dowodów na natywne kontakty dalekiego zasięgu w rozwiniętym białku. Co więcej, Funkcja J (wN), która informuje o ruchu w skali czasu ps–ns, wykazała zmienność zależną od sekwencji, która może być skorelowana ze zmiennością obliczonego parametru, „przeciętnego obszaru Zakopanego po złożeniu” (AABUF) (10)., Ten parametr, który obejmuje zarówno wielkość pozostałości, jak i hydrofobowość, jest zdefiniowany dla poszczególnych aminokwasów, ale jest zwykle uśredniony w oknie od pięciu do dziewięciu reszt w sekwencji i zapewnia alternatywną ilościową estymację hydrofobowości zdefiniowanej przez Mathesona i Scheraga (3) w kategoriach wolnej energii tworzenia. W przypadku apomioglobiny o pH 2,3, piki na wykresie J (wN) vs., liczba pozostałości, które wskazują na ograniczenie ruchu w skali czasu sub-ns, korespondowała bardzo dobrze ze szczytami na wykresie AABUF, które wskazują na wyższą niż średnia liczbę dużych i / lub niepolarnych aminokwasów. Ta obserwacja sugerowała, że w sekwencji aminokwasów istnieje wzór, określony przez grupy dużych i / lub niepolarnych łańcuchów bocznych, jak w modelu ref. 3, co prowadzi do ograniczenia ruchu szkieletu polipeptydowego spowodowanego lokalnym tworzeniem klastrów hydrofobowych.
Apomioglobina przy pH 2.,3 zachowuje małą skłonność do budowy Helik w helisach A I H, ocenianą na podstawie obserwowanych przesunięć chemicznych NMR (34). Skłonności te są zniesione w obecności 8 M mocznika (35), jednak zależność Sekwencyjna szybkości relaksacji urea-denaturowanej apomioglobiny wykazuje również intrygującą korelację z parametrem AABUF. W tym przypadku korelacja jest między minimami w J (wH) i maksymami AABUF, co sugeruje, że lokalne oddziaływania hydrofobowe, które ograniczają ruch szkieletu w skalach czasowych sub-NS, są trwałe nawet w 8 M mocznika.,
aby sprawdzić hipotezę, że parametr aabuf, tj. hydrofobowość, może być użyty do przewidywania miejsc składania inicjacji w łańcuchu polipeptydowym, wykonano specyficzny zestaw mutacji apomioglobiny (23). Helisa a, która uczestniczy w półprodukcie kinetycznym, który powstaje po raz pierwszy po złożeniu apomioglobiny WT, ma sekwencję, która daje maksimum w parametrze aabuf, podczas gdy helisa E, która jest w rzeczywistości wysoce hydrofobowa zgodnie z konwencjonalnymi skalami hydrofobowości, ma raczej niski AABUF na całej swojej długości., W składanej apomioglobinie łańcuch boczny Trp-14, w helisie A, leży naprzeciwko szkieletu helisy E w Gly-73. Opracowano podwójną zmutowaną mioglobinę, w której Trp-14 zastąpiono Gly, a Gly-73 zastąpiono Trp. Stwierdzono, że składana struktura białka powinna być minimalnie zakłócona przez ten swap, ale parametr aabuf dla Helis A i E powinien zostać drastycznie zmieniony. Pytanie brzmiało, czy będzie miało to również wpływ na ścieżkę składania. Rzeczywiście, składanie się mutanta, w którym G73 i W14 są zamieniane, odbywa się inną drogą niż białko WT., Wszystkie warianty apomioglobiny, które do tej pory były badane, składają się przez fazę pośrednią, która zawiera strukturę spiralną. W przypadku apomioglobiny WT półprodukt ten zawiera helisy A, G I H (a także część helisy B). W G73-W14 Mutant swap zawiera helisy E, G I H; helisa a nie jest chroniona w początkowej fazie składania, ale składa się później. Wynik ten (zilustrowany na Rys. 4) zostało potwierdzone przez badania na etykiecie spinowej pokazujące kontakty między helisami E, G I H w mutancie, a nie kontaktami A, G I H obserwowanymi w białku WT.,