Czarna Śmierć z lat 1347-1351, spowodowana bakterią Yersinia pestis2,3, stanowi jeden z najlepszych historycznych przykładów pojawiającej się infekcji o szybkim rozprzestrzenianiu się i wysokiej śmiertelności, według szacunków 30-50% populacji europejskiej w ciągu zaledwie pięciu lat4. Rozbieżności w tendencjach epidemiologicznych między średniowieczną chorobą a współczesnymi zakażeniami Y. pestis wywołały kontrowersje związane z czynnikiem etiologicznym pandemii 5,6., Chociaż starożytne badania DNA silnie uwikłały Y. pestis2,3 w starożytną pandemię, zmiany genetyczne bakterii mogą być częściowo odpowiedzialne za różnice w objawach choroby i nasileniu. Aby zrozumieć ewolucję organizmu, należy scharakteryzować zmiany genetyczne związane z jego przemianą z patogenu sylvatic w patogen zdolny do pandemicznej infekcji człowieka w skali czarnej śmierci oraz określić jego związek z obecnie krążącymi szczepami., Tutaj zaczynamy tę dyskusję od przedstawienia pierwszego projektu sekwencji genomu starożytnego patogenu.
Y. pestis jest niedawno wyewoluowanym potomkiem żyjącego w glebie bacillus Yersinia pseudotuberculosis7, który w trakcie swojej ewolucji nabył dwa dodatkowe plazmidy (pMT1 i pPCP1), które zapewniają mu wyspecjalizowane mechanizmy infiltracji gospodarzy ssaków. Aby zbadać potencjalne zmiany ewolucyjne w jednym z tych plazmidów, zgłosiliśmy na przesiewanie 46 zębów i 53 kości Z East Smithfield collection w Londynie, Anglia na obecność Y., pestis-specific pPCP1 (ref. 3). Dane historyczne wskazują, że Cmentarzysko East Smithfield zostało założone pod koniec 1348 lub na początku 1349 roku specjalnie dla pochówków ofiar czarnej Śmierci8 (dodatkowe Rys. 1 i 2), dzięki czemu kolekcja dobrze nadaje się do badań genetycznych starożytnego Y. pestis. Dane sekwencji DNA dla pięciu zębów uzyskane poprzez molekularne wychwytywanie pełnego pPCP1 specyficznego dla Y. pestis ujawniły wzór uszkodzenia C do T charakterystyczny dla autentycznego endogennego starożytnego DNA9, a montaż połączonych odczytów Illumina pozwolił na rekonstrukcję 98,68% z 9.,Plazmid 6-kilobazy o co najmniej podwójnym pokryciu 3.
aby ocenić przydatność metod opartych na wychwytywaniu do rekonstrukcji całego starożytnego genomu, wiele ekstraktów DNA z korzeni i Koron pochodzących z czterech z pięciu zębów, które dały najwyższy stopień pokrycia ppcp13, wykorzystano do wzbogacania opartego na tablicach (Agilent) i późniejszego sekwencjonowania o wysokiej przepustowości na platformie Illumina GAII10. Usunięcie duplikatów cząsteczek i późniejsze filtrowanie dało łącznie 2 366 647 wysokiej jakości odczytów chromosomalnych (tabela uzupełniająca 1a, b) o średniej długości fragmentu 55.,53 pary bazowe (rys. uzupełniający 4), co jest typowe dla starożytnego DNA. Szacunki pokrycia przyniosły średnio 28,2 odczytów na miejsce dla chromosomu i 35,2 i 31,2 dla plazmidów pCD1 i pMT1, odpowiednio (ryc. 1a, c, d i tabela uzupełniająca 1B, c). Zasięg był przewidywalnie niski dla pPCP1 (rys. 1e) ponieważ sondy specyficzne dla tego plazmidu nie zostały uwzględnione na tablicach. Pokrycie skorelowane z zawartością GC (dodatkowe rys. 6), trend wcześniej obserwowany dla danych o wysokiej przepustowości sekwencji11., Zasięg na każdej połowie chromosomu był nierównomierny ze względu na różnice w głębokości sekwencjonowania między dwiema tablicami, z średnią odczytów na miejsce odpowiednio 36,46 i 22,41 dla tablicy 1 i tablicy 2. Chociaż większa głębokość przyczyniła się do większej średniej liczby odczytów na obiekt, nie zwiększyła ogólnego zasięgu, przy czym obie tablice pokrywały 93,48% docelowych regionów przy co najmniej jednokrotnym zasięgu (tabela uzupełniająca 1b)., Oznacza to, że nasza procedura przechwytywania pomyślnie odzyskała cząsteczki szablonów ze wszystkich regionów genomowych dostępnych za pomocą tej metody i że głębsze sekwencjonowanie nie spowodowałoby dodatkowych danych dla regionów szablonów CO92 nieobjętych naszym zestawem danych.
A, c–e, wykresy pokrycia chromosomu (a) i plazmidów pMT1 (c), pCD1 (d) i pPCP (e). Pokrycie w Kolorze Niebieskim, zawartość GC w kolorze zielonym., Linie podziałki wskazują 10-, 20-, 30-, 40- oraz 50-krotne pokrycie i 10%, 20%, 30%, 40% i 50% zawartości GC. Dla plazmidów czerwony odpowiada regionom kodującym, żółty elementom ruchomym. Chromosom wykazuje średni zasięg na gen. Plazmidy pokazują każde miejsce wykreślone. Rozkład pokrycia dla plazmidów przedstawiono na rysunku dodatkowym. 5. B, dystrybucje pokazują chromosomowe pokrycie tablicy 1 (Niebieski) i tablicy 2 (czerwony), co wskazuje, że głębsze sekwencjonowanie zwiększa liczbę odczytów na miejsce, ale nie ma znaczącego wpływu na ogólny zasięg.,
PowerPoint slide
Aby ekstrapolować kolejność genów w naszym starożytnym genomie, przeanalizowaliśmy mapowanie odczytów do odniesienia CO92 dla wszystkich ekstraktów pochodzących od pojedynczego osobnika, który uzyskał najwyższy zasięg (osobnik 8291). Pomimo krótkiej długości odczytu naszych starożytnych sekwencji i wysoce powtarzalnej natury genomu Y. pestis, wyodrębniono 2221 contigs pasujących do CO92, w tym łącznie 4 367 867 bp., Aby zidentyfikować potencjalne regiony starożytnego genomu, które są architektonicznie odmienne od CO92, wszystkie odczyty nie odwzorowujące odniesienia do co92 były z kolei brane pod uwagę dla konstrukcji contiga. Po przefiltrowaniu przez minimum 500 bp pozostało 2 134 contigów, w tym 4 013 009 bp, z czego 30 959 pochodziło z niezmapowanych odczytów. Konwencjonalne przeszukiwanie wybuchów zapytało o Genom CO92 zidentyfikowane dopasowania dla 2,105 contigs. Dowody na zmianę architektury zostały zidentyfikowane w 10 contigs (dodatkowa Tabela 2). Przykład takiego wariantu konstrukcyjnego pokazany jest na Rys., 2, gdzie zespół prowadzony przez odniesienie zawierający nieoznaczone odczyty w celu rozciągnięcia punktu przerwania potwierdza jego rekonstrukcję. Ta specyficzna orientacja genetyczna występuje tylko w szczepach Y. pseudotuberculosis i Y. pestis Mictrotus 91001, Angola, Pestoides F i B42003004, które są przodkami wszystkich Y. pestis powszechnie związanych z infekcjami ludzkimi (strains 1 i branch 213,14). Ponadto rozbieżności w ułożeniu tego regionu w oddziałach 1 i oddziałach 2 współczesnych szczepów Y. pestis wskazują, że zmiany miały miejsce jako osobne wydarzenia na różnych liniach.,
odczyty mapowane w pozycjach a (niebieska) i B (Zielona) są oddalone od siebie o 231 kb w linearyzowanym genomie CO92. Sąsiadująca sekwencja ma duży zasięg, chociaż tylko 18× i 20× jest wyświetlane z powodu ograniczeń przestrzeni (czerń) odpowiednio dla A i B. Wariant konstrukcyjny został zmontowany za pomocą czytników, które nie odwzorowywały CO92(czerwony)., Jego pozycja jest pokazana na linearyzowanym chromosomie Microtus 91001, gdzie 9096 bp kontig ma 100% tożsamości.
PowerPoint slide
Jednonukleotydowe różnice między naszym starożytnym genomem i CO92 reference zaskakująco składały się tylko z 97 pozycji chromosomalnych oraz 2 i 4 pozycji odpowiednio w plazmidach pCD1 i pMT1 (dodatkowa Tabela 3), co wskazuje na ścisłą ochronę genetyczną w tym organizmie w ciągu ostatnich 660 lat. Dwadzieścia siedem z tych pozycji nie zostało zgłoszonych w poprzedniej analizie istniejącego Y., pestis diversity14 (tabele uzupełniające 3 i 4). Porównanie naszego starożytnego genomu do jego przodka Y. pseudotuberculosis wykazało, że średniowieczna Sekwencja zawierała przodkowy nukleotyd dla wszystkich 97 pozycji, co wskazuje, że nie posiada on żadnych pochodnych pozycji nieobecnych w innych szczepach Y. pestis. Dwie wcześniej zgłoszone różnice chromosomowe3 nie były obecne w naszych danych dotyczących sekwencji genomowej, co sugeruje, że prawdopodobnie pochodzą one z deaminowanych cytozyn, które zostały usunięte w obecnym badaniu za pomocą leczenia uracylem-DNA-glikozylazą przed przechwyceniem tablicy.,
aby umieścić nasz starożytny Genom w kontekście filogenetycznym, scharakteryzowaliśmy wszystkie 1694 wcześniej zidentyfikowane filogenetycznie pozycje informacyjne14 (tabela uzupełniająca 4) i porównaliśmy te z naszego starożytnego organizmu z zagregowanymi danymi bazowymi dla 17 publicznie dostępnych genomów Y. pestis i przodków Y. pseudotuberculosis. Rozważając oddzielnie, sekwencje trzech z czterech ofiar składają się tylko z dwóch podstawień z korzenia wszystkich istniejących ludzkich patogennych szczepów Y. pestis (rys. 3a) i wykazują bliższy związek z gałęzią 1 Y., pestis niż do oddziału 2; jednak jedna z czterech ofiar (osobnik 6330) została zarażona szczepem, który zawierał trzy dodatkowe pozycje pochodne widziane we wszystkich pozostałych genach oddziału 14. Sugeruje to obecność wielu szczepów podczas pandemii w Londynie w latach 1348-1350 lub mikroewolucyjne zmiany zachodzące w jednym szczepie, o których wiadomo, że występują w czasie epidemii chorobowej15. Dodatkowe wsparcie dla Y., mikroewolucja pestis wskazuje na obecność kilku pozycji wariantowych, dla których dane sekwencyjne od jednego osobnika pokazują dwa różne nukleotydy o porównywalnych częstotliwościach (tabela uzupełniająca 5). Pozycja 2896636, na przykład, jest znaną pozycją polimorficzną w istniejących populacjach Y. pestis14, a pozycja ta pokazuje stały stan Pochodny w jednym osobniku (6330) i stan polimorficzny w innym (osobnik 8291) przy minimalnym pięciokrotnym pokryciu (dodatkowa rys. 7). Stanowi to niezwykły przykład mikroewolucji uchwyconej podczas historycznej pandemii., Pozostałe pozycje wariancji są niezmienione w 18 istniejących genomach Yersinia, dlatego mogą być unikalne dla starożytnego organizmu i dlatego są przedmiotem dalszego zainteresowania. Dodatkowe próbkowanie starożytnych genomów pomoże w określeniu częstotliwości tych mutacji we współbieżnych szczepach Y. pestis i wyjaśni pojawienie się szczepów gałęzi 2, które nie są jeszcze zgłoszone w starożytnych próbkach.
a, mediana sieci starożytnych i współczesnych Y. pestis na podstawie 1694 pozycji wariantów we współczesnych genomach14. Kolorowe kółka reprezentują różne klady określone w ref. 13. Szare kółka reprezentują hipotetyczne węzły. b, drzewo filogenetyczne z 1694 zmiennymi pozycjami. Odstępy czasowe rozbieżności są pokazane w latach kalendarzowych, z podporą Bootstrap (niebieska kursywa) i Bayesowskim prawdopodobieństwem tylnym (niebieska). Szare pole wskazuje znane szczepy patogenne człowieka., A, NZ ACNQ01000; Nepal516, NC 008149; KIM10, NC 004088; B, NZ AAYT01000; C, NZ ABAT01000; D, NZ ACNS01000; E, NZ AAYS01000; F, NZ AAOS02000; CO92, NC 003143; G, NZ ABCD01000; H, NZ AAYV01000; I, NC 014029; J, NZ AAYR01000; Antiqua, NC 008150. c, Geographical origin of genome sequences used in a and b. d, Geographical spread of the Black Death from infection routes reported in ref. 4.,
PowerPoint slide
spójne topologie drzew zostały wytworzone przy użyciu kilku metod konstrukcyjnych, a wszystkie główne węzły były obsługiwane przez wartości prawdopodobieństwa tylnego (pp) >0.96 i wartości bootstrap > 90 (rys. 3b i dodatkowe figi 8 i 9). Drzewa umieszczają sekwencję East Smithfield w pobliżu węzła przodków wszystkich istniejących ludzkich patogennych szczepów Y. pestis (tylko dwie różnice w 1694 pozycjach) i u podstawy gałęzi 1 (rys. 3b)., Bezpieczna data dla terenu East Smithfield z lat 1348-1350 pozwoliła nam przypisać kalibrację końcówki do starożytnej sekwencji i tym samym datować czas rozbieżności współczesnego genomu i genomu East Smithfield przy użyciu podejścia bayesowskiego. Szacunki czasowe wskazują, że wszystkie y., pestis powszechnie związane z infekcją człowieka miał wspólnego przodka gdzieś pomiędzy 668 a 729 lat temu (ad 1282-1343, 95% najwyższa gęstość prawdopodobieństwa, HPD), obejmując znacznie mniejszy przedział czasu niż ostatnio opublikowane szacunki 14 i dalej wskazując, że wszystkie obecnie krążące Izolaty gałęzi 1 i gałęzi 2 pojawiły się najwcześniej w XIII wieku (rys. 3b), potencjalnie Pochodzące ze źródeł wschodnioazjatyckich, jak sugerowano wcześniej14., Oznacza to, że średniowieczna zaraza była głównym wydarzeniem historycznym, które wprowadziło populacje ludzkie do przodka wszystkich znanych patogennych szczepów Y. pestis. To dalej kwestionuje etiologię zarazy Justyniana z VI do VIII wieku, popularnie uważaną za wynikającą z tego samego patogenu: nasze czasowe szacunki sugerują, że pandemia była albo spowodowana przez odmianę Y. pestis, która różni się od wszystkich obecnie krążących szczepów powszechnie związanych z ludzkimi infekcjami, albo była to zupełnie inna choroba.
Chociaż nasze podejście do używania istniejącego Y., szablon odniesienia pestis do projektowania przynęty wykluczył naszą zdolność do identyfikacji regionów genomowych, które mogły być obecne w starożytnym organizmie, a następnie zostały utracone w CO92, genomiczne porównania naszej starożytnej sekwencji z najbliższymi grupami mogą dać cenny wgląd w ewolucję Y. pestis. Szczep Microtus 91001 jest najbliżej spokrewniony z gałęzią 1 i gałęzią 2, co zostało potwierdzone jako niepatogenne dla człowieka16, stąd zmiany genetyczne mogą stanowić wkład w adaptację patogenu do ludzkiego żywiciela., Porównania z tą grupą wykazały 113 zmian (tabela uzupełniająca 6a, b), z których wiele znajduje się w genach wpływających na funkcje związane z zjadliwością, takie jak tworzenie biofilmu( hmsT), nabywanie żelaza (iucd) lub adaptacja do środowiska wewnątrzkomórkowego (phoP). Podobnie, chociaż potencjał zjadliwości u ludzi nie został jeszcze potwierdzony, Y. pestis b42003004 wyizolowany z Chińskiej populacji świstaków17 został zidentyfikowany jako szczep najbliższy węzłowi przodkowemu wszystkich Y., pestis powszechnie związane z plagą człowieka, a tym samym może dostarczyć kluczowych informacji dotyczących ewolucji organizmu. Pełne porównanie genomu z sekwencją East Smithfielda ujawniło tylko osiem różnic jednonukleotydowych( tabela uzupełniająca 6c), z których sześć prowadzi do zmian nie-synonimicznych (tabela uzupełniająca 6d). Chociaż te różnice prawdopodobnie nie wpływają na zjadliwość, wpływ utraty genów, przyrostu genów lub zmian genetycznych, z których wszystkie są dobrze udokumentowane w Y. pestis12,18, jest jeszcze nieokreślony., W nowszych ewolucyjnych terminach, jednonukleotydowe różnice w kilku znanych genach związanych z patogennością zostały znalezione pomiędzy naszym starożytnym genomem a sekwencją referencyjną CO92 (dodatkowa Tabela 3), która może reprezentować dalsze adaptacje do ludzkich gospodarzy.,
poprzez wzbogacenie poprzez przechwytywanie DNA w połączeniu z ukierunkowanym sekwencjonowaniem DNA o wysokiej przepustowości, zrekonstruowaliśmy projekt genomu dla tego, co jest prawdopodobnie najbardziej niszczycielskim ludzkim patogenem w historii, i ujawniliśmy, że średniowieczna plaga z XIV wieku była prawdopodobnie odpowiedzialna za jego wprowadzenie i rozpowszechnienie w populacjach ludzkich. Wskazuje to, że patogen uwikłany w czarną śmierć ma bliskich krewnych w XXI wieku, którzy są zarówno endemiczni, jak i pojawiający się19., Wprowadzanie nowych patogenów do populacji często wiąże się ze zwiększoną częstością występowania i nasileniem chorob20 i chociaż mechanizmy rządzące tym zjawiskiem są złożone21, dane genetyczne Pochodzące ze starożytnych chorób zakaźnych wniosą nieoceniony wkład w nasze zrozumienie koewolucji gospodarza z patogenem. Czarna Śmierć jest przełomowym przykładem pojawiającej się infekcji, która przemierza Europę i odbiera życie około 30 milionom ludzi w ciągu zaledwie 5 lat, czyli znacznie szybciej niż współczesne wskaźniki infekcji dżumą lub dżumą płucną22 i jej rozpowszechniania7,8., Niezależnie od tego, chociaż żaden istniejący szczep Y. pestis nie posiada takiego samego profilu genetycznego jak nasz starożytny organizm, nasze dane sugerują, że niewiele zmian w znanych genach związanych z zjadliwością pojawiło się w ciągu 660 lat ewolucji organizmu jako ludzkiego patogenu, co dodatkowo sugeruje, że jego zwiększona zjadliwość w historii23 może nie wynikać z nowych mutacji punktowych wykrywalnych za pomocą opisanego tutaj podejścia analitycznego., W obecnej rezolucji postulujemy, że zmiany molekularne w patogenach są tylko jednym z elementów konstelacji czynników przyczyniających się do zmiany częstości występowania i nasilenia chorób zakaźnych, gdzie genetyka populacji żywicielów24, klimatu25, dynamiki wektorów26, uwarunkowań społecznych27 oraz interakcje synergiczne z współistniejącymi chorobami28 powinny być przede wszystkim przedmiotem dyskusji na temat podatności populacji na choroby zakaźne i zależności żywiciel–patogen w odniesieniu do zakażeń Y. pestis.