granice w weterynarii

wprowadzenie

Bezkręgowce obejmują około miliona gatunków zwierząt trzymanych zarówno w instytucjach zoologicznych, jak i w gospodarstwach domowych, gdzie są ręcznie hodowane jako zwierzęta egzotyczne (1). Ślimaki obejmują prawie 60 000 gatunków wodnych i lądowych mięczaków, głównie ślimaków i ślimaków (1). Afrykański ślimak lądowy (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) pochodzi z Afryki Wschodniej, jednak jest szeroko rozpowszechnionym gatunkiem inwazyjnym w Azji, Oceanii, a ostatnio w obu Amerykach, gdzie został przypadkowo lub celowo wprowadzony jako źródło pożywienia i jako zwierzę domowe. Jego uwolnienie w naturalnych ekosystemach, obszarach rolniczych i miejskich spowodowało zagrożenia ekologiczne, zdrowotne i rolnicze (2, 3). Olbrzymi Afrykański ślimak lądowy jest żywicielem pośrednim dla kilku pasożytów, w tym Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp.,, oraz Fasciola hepatica (4, 5). Wszystkie powyższe robaki, z wyjątkiem A. abstrusus, są w stanie powodować ciężkie choroby u ludzi. W szczególności, olbrzymi Afrykański ślimak lądowy jest głównym ślimakiem odpowiedzialnym za rozprzestrzenianie się na całym świecie A. cantonensis, który powoduje ludzkie eozynofilowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych w Azji i obu Amerykach (2, 6). Czynniki ryzyka infekcji u ludzi, zwierząt domowych i dzikich zwierząt z tymi pasożytami robaków obejmują spożycie surowych lub niedogotowanych zakażonych ślimaków lub ślimaków lub żywności zanieczyszczonej śluzem zakażonych ślimaków lub ślimaków (4, 5, 7, 8).,

chociaż ślimaki lądowe są jednymi z najpopularniejszych ślimaków trzymanych jako zwierzęta domowe, a ich światowa popularność jako zwierząt egzotycznych szybko rośnie, przeprowadzono tylko kilka badań dotyczących występowania ich pasożytów w warunkach naturalnych (2, 6, 9-11). Celem badań było zbadanie występowania pasożytów u olbrzymich afrykańskich ślimaków lądowych hodowanych jako zwierzęta domowe w południowych Włoszech.,

materiały i metody

Dane ogólne

w sierpniu 2018 r.zbadano trzy baseny świeżych próbek kału uzyskanych z łącznie 60 gigantycznych afrykańskich ślimaków lądowych, przechowywanych w trzech różnych prywatnych kolekcjach znajdujących się w Pozzuoli, Casercie i Neapolu (Włochy) pod kątem pasożytów. Z każdej miejscowości otrzymaliśmy pulę odchodów od 20 pojedynczych ślimaków. Średni wiek ślimaków uczestniczących w badaniu wynosił od 0,2 do 2 lat i nie były wcześniej leczone przeciwpasożytniczo., Ślimaki karmiono świeżymi warzywami i owocami; dodatkowo uzupełniano wapń w proszku (Calcium, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Niemcy) dostarczano dwa razy w tygodniu. Wszystkie zwierzęta zostały wyhodowane we Włoszech, prywatne i trzymane jako zwierzęta domowe w czterech wewnętrznych terrariach o wymiarach 60 × 30 × 45 cm, w grupach po 10-20 zwierząt (2 grupy po 20 ślimaków w Pozzuoli i Casercie oraz 2 grupy po 10 ślimaków w Neapolu)., Jako podłoże zastosowano organiczną glebę torfową (Organic Coco-torf Soil, e-Coco Products, Gloucestershire, Wielka Brytania), uprzednio poddaną obróbce cieplnej (100°C przez 30 min), a następnie wolną od pasożytów i owadów.

procedury diagnostyczne

początkowo z każdego z czterech terrarium pobrano dwadzieścia gramów świeżego kału., Gdy zbiorcze odchody analizowane za pomocą rozmazu świeżego, flotacja i test Baermanna wykazały dodatni wpływ na nicienie prążkowane, dwa ślimaki z każdego dodatniego terrarium umieszczono pojedynczo w sterylnym plastikowym pudełku, a ich odchody pobrano bezpośrednio po wypróżnieniu w sterylnej plastikowej tubce o pojemności 50 ml. Badanie koprologiczne dla próbek zbiorczych i pojedynczych obejmowało świeży rozmaz, flotację odśrodkową (2 g kału dla każdego badania) przy użyciu roztworu cukru i formaldehydu (ciężar właściwy 1,27) oraz test Baermanna (10 g kału dla każdego badania)., Dodatkowo śluz uzyskany podczas badania świeżego rozmazu analizowano pod mikroskopem świetlnym. Ponieważ formy larwalne kilku gatunków robaków mogą encyst wewnątrz mięśni stóp ślimaków, badanie histologiczne próbek biopsji pobranych z przednich i tylnych obszarów mięśnia stopy przeprowadzono u 30 ślimaków, znieczulonych techniką opisaną przez Giannelli et al. (12) oraz Gilbertson i Wyatt (13)., Próbki biopsji były utrwalane w 10% neutralnej formalinie buforowanej fosforanami i przetwarzane metodami rutynowymi na bloki parafinowe, które pocięto na sekcje o grubości 3 µm i barwiono hematoksyliną i eozyną. Badanie zostało przeprowadzone za zgodą praktyki, w której miało miejsce i pod podpisaną, pisemną świadomą zgodą właściciela.

Identyfikacja morfologiczna

montowano tymczasowe nicienie zabijające ciepło na szkiełkach w kropli wody, po czym nakładano poślizg pokrywy szklanej., Nicienie przenoszono do kropli wody z kranu na szklanym szkiełku i umieszczano na grzałce (100°C) przez 10 s. okazy te służyły do identyfikacji morfologicznej. Do obserwacji wykorzystywano AMPLIMICZNY mikroskop świetlny Carl Zeiss Jena oraz Diaplan Leitza z optyką Nomarskiego., Identyfikacja morfologiczna nicieni rabditid następowała po Andrassy (14) i Andrassy (15) i opierała się głównie na morfologii gardła i stomii oraz układu rozrodczego, głównie cechach kolców, liczbie i położeniu brodawek lub obecności i wielkości lub kształtu Bursy u samców oraz kształcie ogona, położeniu sromu i morfologii układu rozrodczego u samic. Identyfikacja larw opierała się na kształcie ogona.

Analiza molekularna

DNA wyekstrahowano z próbek nicieni uzyskanych z odchodów utrwalonych w 96% etanolu zebranych z trzech miejscowości., Nicienie przemywano w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O) przez noc, przed analizą molekularną, w celu całkowitego usunięcia pozostałości etanolu. Każdy pojedynczy nicień został przeniesiony do sterylnej probówki Eppendorfa (200 µl) z 20 µl buforu ekstrakcyjnego (17,7 µl ddH2O, 2 µl 10 × stężonego buforu PCR, 0,2 µl 1% Tween 20 i 0,1 µl proteinazy K). Bufor i nicienie były zamrażane w temperaturze -20°C przez 20 minut, a następnie natychmiast inkubowane w temperaturze 65°C przez 1 godzinę, a następnie przez 10 minut w temperaturze 95°C., Lizaty chłodzono na lodzie, a następnie odwirowano (2 min, 9000 g); do PCR użyto 1 µl supernatantu.

fragment rDNA zawierający wewnętrzne transkrybowane regiony dystansowe (ITS1, 5.8 s, ITS2) został wzmocniony przy użyciu primerów 18S: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (przód) i 28S: 5′-TTT CAC tcg CCG TTA CTA AGG-3′ (tył) (16). Fragment rDNA zawierający gen dla 18S rRNA został wzmocniony przy użyciu primerów 22F: 5′- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3′ (do przodu) oraz 1080jr: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3′ (do tyłu) (17). PCR master mix składał się z: ddH2O, 7.,25µl; 10 × bufor PCR, 1,25 µl; trifosforany deoksynukleozydów( dNTPs), 1 µl; 0,75 µl zarówno przedniego, jak i wstecznego podkładu; polimeraza, 0,1 µl; i 1 µl ekstraktu DNA. Profile PCR były stosowane w następujący sposób: dla 1 cyklu 94°C przez 7 min, następnie 35 cykli 94°C przez 60 s, 50°C przez 60 S I 72°C przez 60 s, a końcowe wydłużenie w temperaturze 72°C przez 7 min (14); dla 18S 1 cykl 94°C przez 5 min, następnie 35 cykli 94°C przez 60 s, 55°C przez 90 s i 72°C przez 2 min i końcowe wydłużenie w temperaturze 72°C przez 7 min (14); dla 18S 1 cykl 94 ° C przez 5 min, a następnie 35 cykli 94 ° C przez 60 s, 55 ° C przez 90 s i 72 ° C przez 2 min i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 ° C przez 10 min., Produkty PCR zostały uporządkowane przez GATC Biotech (Niemcy), a następnie edytowane i przesłane do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

wyniki

badanie Baermanna wykazało obecność larw nicieni, których długość wynosiła od 170 do 336 µm, we wszystkich próbkach. Jaja, larwy i dorosłe nicienie prążkowane wykryto metodą rozmazu świeżego i flotacji we wszystkich próbkach kału. Rhabditella axei (ryc. 1) zidentyfikowano morfologicznie na podstawie dwóch z trzech zbiorczych i pojedynczych próbek kału z Pozzuoli i Neapolu. Ponadto Rhabditis terricola, Cruznema Sp.,, a Entomophagus Pristionchus wyizolowano z jednego basenu i pojedynczych próbek kału z Caserty. W próbkach biopsji mięśni ani w śluzie nie wykryto pasożytów.