FISH Testing in Cancer (Polski)

rak odnosi się do złożonej i heterogenicznej grupy chorób charakteryzującej się niekontrolowaną i nieuporządkowaną proliferacją komórek, które często nabywają zdolność do inwazji na inne tkanki. Nowotwór zwykle powstaje w komórkach somatycznych, które w wyniku szeregu mutacji genetycznych unikają mechanizmów regulujących homeostazę tkanek, takich jak hamowanie kontaktu komórki z komórką, sygnały różnicowania i indukcja śmierci komórki., Mutacje odpowiedzialne za transformację nowotworową dotyczą dwóch głównych grup genów, zwanych protoonkogenami (stymulatorami cyklu komórkowego) i supresorami nowotworu (represorami progresji cyklu komórkowego). Te zmiany funkcjonalne mogą wystąpić w wyniku mutacji pojedynczych nukleotydów, ale mogą być również spowodowane większymi modyfikacjami w materiale genetycznym, takimi jak insercje, delecje, duplikacje lub translokacje fragmentu chromosomu. Te nieprawidłowości w komórkach nowotworowych mogą być stosowane jako biomarkery nowotworu., Kwantyfikacja zmian w liczbie kopii genów lub rearanżacji genów jest krytyczna dla naszego zrozumienia biologii nowotworu, stąd znaczenie badań genetycznych opartych na profilowaniu cytogenetyki molekularnej.

Co to jest ryba ?

Fluorescence in situ hybridization (FISH) jest techniką cytogenetyczną stosowaną do wykrywania i lokalizacji sekwencji nukleotydów (DNA lub RNA) w tkankach lub komórkach., Ryby mogą być wykorzystywane do „mapowania” materiału genetycznego w komórkach ludzkich, dostarczając informacji o lokalizacji, długości i liczbie kopii określonych genów lub porcji chromosomów. Wymaga syntezy sondy znakowanej fluorescencyjnie, która jest sekwencją kwasu nukleinowego związaną z fluorescencyjną cząsteczką reportera, która następnie wiąże się (hybrydyzuje) z określoną sekwencją docelową. Sondy rybne mogą być oznaczane różnymi metodami (np. translacja Nicka, losowe gruntowanie), począwszy od różnych kwasów nukleinowych, takich jak genomowe DNA/RNA, bakteryjne sztuczne chromosomy (BACs) lub kosmowce.,
pierwszym krokiem w procesie FISH jest unieruchomienie chromosomów metafazy lub komórek międzyfazowych zawierających docelowe DNA na szkiełku szklanym. Następnie zarówno Próbka DNA, jak i sonda ryb są denaturowane przez ciepło. Gdy sonda jest w kontakcie z docelowym materiałem genetycznym, to specyficznie wiąże się z jego komplementarnej sekwencji na chromosomie. Hybrydy utworzone między sondami a ich celami sekwencyjnymi można następnie wizualizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 1)., Ogólnie można wyróżnić dwa rodzaje sond rybnych: sondy do oznaczania chromosomów (CEPs lub CENs) ukierunkowane na perycentromeryczne regiony chromosomów i używane do wyliczania chromosomów; i wskaźniki specyficzne dla locus (LSI) rozpoznające geny będące przedmiotem zainteresowania.

FISH ma kilka zalet w stosunku do innych klasycznych technik cytogenetycznych, takich jak kariotypowanie G-banding. Po pierwsze, ma wyższą rozdzielczość(20-150KB vs 5MB). Ponadto ryby mogą być stosowane zarówno do metafazy, jak i chromosomów międzyfazowych, co oznacza, że komórki nie muszą być hodowane przez kilka dni, zanim chromosomy mogą być przygotowane do analizy., Oznacza to również, że FISH nadaje się do analizy różnych rodzajów próbek, w tym guzów litych i tkanek osadzonych parafiną na bazie formaliny (FFPE). Ponadto sondy rybne mogą być oznaczone różnymi fluoroforami, co pozwala na jednoczesne monitorowanie wielu miejsc.

aberracje chromosomowe ryb w raku

dzięki swojej wszechstronności ryby mogą być wykorzystywane do analizy cytogenetycznej zarówno guzów litych (np. rak piersi, niedrobnokomórkowy rak płuca, rak jelita grubego), jak i hematologicznych lub nowotworowych krwi (np. białaczka, chłoniaki, szpiczak mnogi)., Wykrywanie nieprawidłowości genetycznych jest przydatne nie tylko w przypadku raka, ale także jako narzędzie do analizy predyspozycji genetycznych i informacji specyficznych dla choroby oraz do przewidywania wyniku chemioterapeutycznego.

rak płuc

rak płuc jest najczęściej diagnozowaną i główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami. W szczególności, niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC) stanowi ~80-85% wszystkich nowotworów płuc. Mutacje somatyczne w genach EGFR i ALK są często związane z NSCLC., EGFR (receptor naskórkowego czynnika wzrostu) jest klasą receptorów kinaz tyrozynowych, których aktywność jest deregulowana w różnych typach nowotworów nabłonkowych (w tym raka płuc), ponieważ odgrywają ważną rolę w proliferacji komórek nowotworowych, angiogenezie i przerzutach. Z tego powodu różne strategie zakłócania funkcji EGFR są powszechnie wykorzystywane w leczeniu pacjentów. Inhibitory aktywności kinazy tyrozynowej tych receptorów (np. erlotynib, gefitynib) są szeroko stosowane w leczeniu klinicznym NSCLC., Niestety, ze względu na różnorodność mutacji genetycznych leżących u podstaw dysfunkcji EGFR, niektórzy pacjenci są niewrażliwi na tego typu leczenie. Różne grupy pacjentów można rzeczywiście odróżnić na podstawie rodzaju zmian przenoszonych przez EGFR, takich jak amplifikacja genów, delecja lub podstawienia pojedynczych nukleotydów, które mogą zmieniać swoją aktywność na różne sposoby (tj. nie za pośrednictwem domeny kinazy tyrozynowej). W rezultacie liczba kopii EGFR określona przez FISH jest jednym z biomarkerów używanych do wyboru prawidłowej terapii.,

FISH jest powszechnie stosowany do wykrywania inwersji lub translokacji w genie ALK. Gen ALK znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 2 (2p23) i koduje receptor transmembrany kinazy tyrozynowej. ALK nie powinien być wyrażony w płucach dorosłych. Jednak w warunkach patologicznych Gen ALK łamie się i łączy swoje 3′ (zawierające domenę kinazy tyrozynowej) z 5′ innych genów. Zdarzenie to może prowadzić do niekontrolowanej aktywacji ALK. Najczęściej dochodzi do fuzji z EML4, z powodu inwersji na krótkim ramieniu chromosomu 2.,
FISH jest zatwierdzoną przez FDA metodą wykrywania inwersji lub translokacji w genie ALK. Zazwyczaj sondy celujące w obszar 3′ i 5 ' genu są oznaczone różnymi fluorophorami: w jądrach ujemnych kolory pojawią się blisko siebie (często nakładają się), podczas gdy w komórkach nowotworowych sygnały będą rozdzielać się w wyniku przegrupowania chromosomów (ryc. 4).

trzecia sonda ukierunkowana na potencjalnego partnera ALK może dodatkowo potwierdzić i zdefiniować rearanżację chromosomu zachodzącą u pacjenta (ryc. 4C)., Nowotwory płuc z mutacjami prowadzącymi do hiperaaktywacji ALK można leczyć inhibitorami ALK, takimi jak Kryzotynib.

FISH for Breast Cancer

jest to najczęstszy nowotwór złośliwy u kobiet i druga główna przyczyna zgonów związanych z rakiem na świecie. Rak piersi często charakteryzuje się nieprawidłowościami w stanie receptora, co prowadzi do upregulation komórkowych szlaków transdukcji odpowiedzialnych za proliferację komórek i przeżycia. W szczególności, około 20-30% guzów raka piersi są znane do nadekspresji HER2 / Neu, członek rodziny EGFR., Powszechnym leczeniem w tych przypadkach jest Trastuzumab, humanizowane przeciwciało monoklonalne zatwierdzone przez FDA w 1998 roku do leczenia raka piersi. Jego dokładny mechanizm molekularny pozostaje do wyjaśnienia, ale przeciwciało to prawdopodobnie zapobiega aktywacji HER2 poprzez wiązanie się z jego domeną pozakomórkową. Ponadto wydaje się wywoływać lizę komórek nowotworowych, stymulując cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). FISH, za pomocą odpowiedniej sondy przeciwko HER2, może być stosowany do identyfikacji dodatkowych kopii genu, znak, że jest bardziej prawdopodobne reagować na leczenie trastuzumabem.,

FISH for Bladder Cancer

jest piątym najczęstszym nowotworem złośliwym u ludzi i drugim najczęściej diagnozowanym nowotworem układu moczowo-płciowego po raku prostaty., Jest to choroba poligeniczna, co oznacza, że jest związana z wieloma anomaliami genetycznymi, takimi jak mutacje w genach FGFR3, RB1, HRAS, TP53 lub TSC1. Jednak Zdarzenie inicjacyjne jest prawdopodobnie mutacją w regionie 9p21, zawierającym Gen p16 / CDKN2A. Ponadto komórki raka pęcherza moczowego charakteryzują się podwyższonym stopniem niestabilności chromosomów (CIN). Dysfunkcyjne powielanie lub segregacja chromosomów podczas mitozy powoduje zmiany i translokacje DNA, zysk lub utratę całych chromosomów (aneuploidia) lub fragmentów chromosomów., Wynikająca z tego nierównowaga materiału genetycznego pogarsza się po każdym cyklu komórkowym. Wynikające wzorce genomiczne mogą być związane z różnymi etapami rozwoju nowotworu, z bardziej inwazyjnych form wyświetlających większą liczbę cytogenetycznych zmian.
numeryczne i strukturalne zmiany chromosomalne występujące w komórkach raka pęcherza moczowego mogą być wykorzystywane jako markery nowotworowe.
w szczególności, jednoczesne wykrywanie zmian liczby kopii chromosomów 3, 7 i 17 oraz delecja regionu 9p21 (zawierającego p16) przez ryby przy użyciu czterech różnych sond jest powszechną praktyką., Metoda ta jest przydatna do dostarczania informacji na temat progresji i nawrotu raka.

FISH for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)

Analiza nowotworów hematologicznych jest jednym z typowych przykładów zalet ryb do analizy próbek charakteryzujących się zmiennym kariotypem i niską aktywnością mitotyczną. PBL jest najczęstszą białaczką u dorosłych. Nie wiąże się to ze specyficzną powtarzającą się zmianą genetyczną., Zamiast tego, podobnie jak rak pęcherza moczowego, zespół różnych mutacji jest związany z różnym nasileniem choroby i są wykorzystywane jako wskaźniki predykcyjne przebiegu klinicznego pacjenta. Panele ryb, w tym przypadku, często zawierają sondy do wykrywania trisomii 12 i delecji 11Q, 13q i 17P., Delecja 11Q, która w większości przypadków dotyczy genu ATM, występuje u pacjentów wykazujących szybką progresję raka; trisomia 12 jest związana z zaawansowanymi stadiami choroby, opornością na chemioterapię i krótszym czasem przeżycia; delecja 13q jest najczęściej spotykana i jest ogólnie związana z bardziej korzystnym rokowaniem; delecja 17P często obejmuje delecję genu TP53 i odpowiada zaawansowanemu stadium nowotworu, ze słabym wskaźnikiem przeżycia.
Enzo Life Sciences jest światowym liderem w dziedzinie technologii etykietowania DNA i RNA., Oferujemy szereg produktów dla Twoich potrzeb w zakresie genomiki i Badań nad Rakiem. Aby uzyskać prostą i skuteczną metodę generowania znakowanego DNA, sprawdź nasz zestaw do etykietowania DNA do tłumaczenia Nicka, a także listę naszych fluorescencyjnych barwników seebright® dUTPs i Allylamine-dUTP. Nie jesteś pewien, czy używać biotyny lub digoksygeniny do etykietowania sond ISH? Możemy Ci tam pomóc! Nie zapomnij sprawdzić Spectra viewer firmy Enzo pod kątem profili wzbudzenia i długości fali emisji zwykłych barwników i innych naszych testów opartych na komórkach fluorescencyjnych., Podczas gdy jesteś na to, sprawdź naszą TechNote na plusy i minusy ryb, aCGH i NGS oraz jak używać allylamine-dUTP do etykietowania sond DNA ryb. W przypadku wszystkich pytań i wątpliwości dotyczących któregokolwiek z naszych produktów, nasz zespół wsparcia technicznego jest tutaj, aby pomóc.