elektroforeza żelowa definicja
elektroforeza żelowa jest procedurą stosowaną do oddzielania cząsteczek biologicznych według wielkości. Rozdzielenie tych cząsteczek uzyskuje się poprzez umieszczenie ich w żelu o małych porach i utworzenie pola elektrycznego w żelu. Cząsteczki będą poruszać się szybciej lub wolniej w zależności od ich wielkości i ładunku elektrycznego.,
elektroforeza żelowa przegląd
proces elektroforezy żelowej działa, ponieważ ujemnie naładowane cząsteczki oddalają się od ujemnego bieguna prądu elektrycznego, a mniejsze cząsteczki poruszają się szybciej niż większe cząsteczki. W ten sposób uzyskuje się separację wielkości w Puli cząsteczek biegnących przez żel. Żel działa podobnie jak sito oddzielające cząstki według wielkości. Elektroforeza działa, aby przenieść cząstki, za pomocą ich nieodłącznego ładunku elektrycznego, przez sito.,
gdy badacze próbują rozróżnić różne segmenty DNA, na przykład, Proces jest prosty. Próbki są ładowane do kanałów na początku żelu. Każda cząsteczka DNA ma ten sam ładunek (-1), ponieważ DNA jest utworzone przez te same 4 nukleotydy i zawsze niesie lekko ujemny ładunek niezależnie od jego wielkości. Dlatego każda cząsteczka DNA będzie miała taką samą siłę ciągnącą ją przez żel.
jednak wielkość każdej cząsteczki utrudnia jej postęp przez żel., Duże cząsteczki uderzają w części matrycy żelowej i są spowolnione. Małe cząsteczki DNA mogą prześlizgnąć się między różnymi składnikami matrycy żelowej i szybko przedostać się na drugą stronę żelu. Po pewnym czasie, barwione cząsteczki DNA mogą być widoczne agregujące się w różnych obszarach żelu, w oparciu o to, jak daleko poruszały się podczas elektroforezy żelu. Pozwala to badaczom zidentyfikować segmenty i porównać DNA różnych organizmów.
do czego służą elektroforezy żelowe?,
celem elektroforezy żelowej jest wizualizacja, identyfikacja i rozróżnianie cząsteczek, które zostały przetworzone za pomocą poprzedniej metody, takiej jak PCR, trawienie enzymatyczne lub warunek eksperymentalny. Często mieszaniny kwasów nukleinowych lub białek, które są zbierane z poprzedniego eksperymentu / metody są prowadzone przez elektroforezę żelową w celu określenia tożsamości lub rozróżnienia między cząsteczkami.,
etapy elektroforezy w żelu
szerokie etapy związane ze wspólnym protokołem elektroforezy w żelu DNA:
Przygotowanie próbek do pracy
DNA jest izolowane i wstępnie przetworzone (np. PCR, trawienie enzymatyczne) i składa się w roztworze z pewnego podstawowego niebieskiego barwnika aby pomóc wizualizować ruch próbki przez żel.
przygotowany jest roztwór żelu agarozowego TAE
bufor Tae stanowi źródło jonów do ustawiania pola elektrycznego podczas elektroforezy., Do przygotowania roztworu stosuje się stężenie agarozy od masy do objętości w buforze TAE. Na przykład, jeśli wymagany jest 1% żel agarozowy, 1 g agarozy dodaje się do 100 ml TAE. Zawartość agarozy zależy od tego, jak duże lub małe jest spodziewane DNA. Jeśli ktoś patrzy na oddzielenie puli mniejszych pasm DNA (<500bp), przygotowuje się wyższy procent żelu agarozowego (>1%). Wyższy procent agarozy tworzy gęstsze sito w celu zwiększenia separacji małych różnic długości DNA., Roztwór agarozy-TAE jest podgrzewany w celu rozpuszczenia agarozy.
Odlewanie żelu
roztwór agarozy wlewa się do tacy odlewniczej, która po ostygnięciu i zestaleniu roztworu żelu tworzy płytkę żelową z rzędem studni na górze.
Ustawianie Komory elektroforezy
żel stały umieszcza się w komorze wypełnionej buforem TAE. Żel jest umieszczony tak, aby studnie komorowe były najbliżej ujemnej elektrody Komory.,
Ładowanie żelu
studzienki komorowe żelu są ładowane próbkami DNA i zwykle drabina DNA jest również ładowana jako odniesienie do rozmiarów.
elektroforeza
przewody ujemne i dodatnie są podłączone do komory i do zasilacza, w którym ustawiane jest napięcie. Włączenie zasilania ustawia pole elektryczne i ujemnie naładowane próbki DNA zaczną migrować przez żel i od ujemnej elektrody w kierunku dodatnim.,
zatrzymanie elektroforezy i wizualizacja DNA
Po tym, jak niebieski barwnik w próbkach DNA migruje przez żel wystarczająco daleko, zasilanie jest wyłączane, a żel jest usuwany i umieszczany w roztworze bromku etydyny. Bromek etydyny interkaluje się między DNA i jest widoczny w świetle UV. Czasami bromek etydyny dodaje się bezpośrednio do roztworu żelu agarozowego w etapie 2. Żel barwiony bromkiem etydy jest następnie wystawiany na działanie światła UV i robi się Zdjęcie. Pasma DNA są wizualizowane z każdego pasa odpowiadającego studni komorowej., Drabina DNA, która została załadowana, jest również wizualizowana i można oszacować długość pasm DNA. Przykład przedstawiono na poniższym rysunku.
rodzaje elektroforezy żelowej
istnieją dwa rodzaje elektroforezy żelowej: natywna i denaturująca. Rodzima elektroforeza żelu zwykle próbuje utrzymać RNA lub białko w swojej macierzystej strukturze podczas prowadzenia go przez żel., Denaturująca elektroforeza żelowa próbuje zredukować RNA lub białko do jego najbardziej liniowej struktury przed lub podczas elektroforezy żelowej.
denaturacja RNA lub białka odbywa się poprzez dodanie czynnika redukującego do próbki, żelu i / lub bufora. Środek redukujący oddziela wiązania w obrębie cząsteczki RNA lub białka, a tym samym zmniejsza jego strukturę wtórną. Drugorzędowa struktura białka lub RNA wpłynie w sposób nieliniowy na szybkość jego migracji przez żel., Jednak denaturowana, liniowa forma RNA lub białka będzie migrować proporcjonalnie do jej rozmiaru liniowego (pary zasad lub kilo Daltonów). Elektroforeza żelu denaturującego jest często dokładniejsza do identyfikacji rozmiaru, podczas gdy natywna elektroforeza żelu jest zwykle używana do identyfikacji większych kompleksów białkowych.
przykłady elektroforezy w żelu
- Tae elektroforeza w żelu agarozowym jest najczęściej stosowana w DNA.
- TBE i Strona Denaturująca (elektroforeza z żelu poliakrylamidowego) są wspólne dla separacji RNA.,
- strona SDS to elektroforeza żelu denaturującego powszechnie stosowana do identyfikacji i separacji białek.