w praktyce znalezienie prawdziwego dopasowania spektralnego pomiędzy dowolnym AU i ludzkim moczem jest niemożliwe, ale stopień podobieństwa jest miarą wiarygodną. Trzy partie AU są porównywane pod względem spektrum SG, pH i IR jako pomiar dopasowania do ludzkiego moczu. Analiza statystyczna jest również stosowana na widmach IR. Po wodzie głównym składnikiem moczu jest mocznik., W rzeczywistości udział widmowy mocznika w AU jest dominujący w porównaniu z innymi składnikami (rys. 1 i dodatkowe rys. S2). Kreatynina i cytrynian sodu są drugim i trzecim składnikiem o głębokim udziale widmowym.
widmo absorpcji w podczerwieni dziewięciu związków stosowanych w preparacie MP-AU. Skalowanie osi pionowych nie jest równe. Względne absorbancje podane są na wykresie 3D na rysunku dodatkowym. / S2, Stosunek sygnału do szumu jest ograniczony w ATR diamond w obszarze 2600-2000 cm-1, a zatem jest wykluczony z wyświetlacza. NaCl, KCl i CaCl2 nie miały żadnej absorpcji w mierzonym oknie i dlatego są wyłączone z obu wartości. Również absorpcja K2C2O4 jest bardzo słaba, a więc jego widmo jest wyłączone z rysunku. Pozycje szczytowe przedstawiono w dodatkowej tabeli S2.
BK-AU, CT-AU i MP-AU są przygotowywane zgodnie z opisem w metodzie. BK-AU i CT-AU mają wspólne substancje chemiczne w swoich protokołach., Jednakże, chociaż oba zawierają wodorowęglan, związek ten nie występuje naturalnie w zdrowym ludzkim moczu1. W związku z tym wodorowęglan nie był stosowany w preparacie MP-AU. Stężenia substancji chemicznych są różne, gdy BK-AU i CT-AU są porównywane, ponieważ oba badania opierają się na innej literaturze dotyczącej składu moczu. Pomimo różnic w formułach, wszystkie AUs mają akceptowalne właściwości fizyczne pod względem SG i pH (Tabela 3), a wszystkie składniki mieszczą się w zakresach fizjologicznych na podstawie katalogu testów Mayo Clinic., Z drugiej strony mocz jest z natury złożonym roztworem, a porównywanie dowolnego preparatu AU z ludzkim moczem w oparciu o tylko dwa parametry (SG i pH) jest co najwyżej ślepym podejściem. Dlatego wykorzystaliśmy analizę spektroskopową z wykorzystaniem FTIR, aby wskazać podobieństwa i / lub różnice między AUs i porównać je z ludzkimi próbkami moczu.
ludzki mocz
widmo absorpcji próbek moczu od 28 zdrowych osób pokazano na Rys. 2. Ogólnie widmo ludzkiego moczu wykazuje ten sam profil, szczególnie w oknie 1800-1200 cm−1 widma. Istnieją jednak znaczne różnice między osobnikami w zakresie 1200-800 cm-1. Może to być spowodowane dietą, różnicami płci i metabolizmu. Po obliczeniu wariancji najbardziej widoczne szczyty wynoszą 1644, 1574, 1436, 1105 i 1065 cm−1., Według naszej bazy danych widm uzyskanych z poszczególnych składników (rys. 1), Zmiany poziomu kreatyniny, cytrynianu, mocznika, fosforanu i kwasu moczowego mogły przyczynić się do tych różnic wraz z innymi składnikami moczu. Średnia z 28 próbek moczu jest obliczana i wykorzystywana do porównania (rys. 2).
widmo absorpcji w podczerwieni 28 zdrowych osób w wieku 20-40 lat., B) obliczone średnie widmo moczu ludzkiego jest pokazane na czarno, a wariancja pomiędzy 28 widmami moczu jest pokazana na Czerwono.
sztuczne mocz
obliczona średnia ludzka mocz jest porównywana z trzema widmami AU, jak pokazano na Rys. 3. Profile i pozycje pasma są podobne w wielu punktach, a mianowicie 1657, 1609, 1447, 1143 i 783 cm−1 (rys. 3). Pasma te pochodzą głównie z mocznika. Istnieją jednak również znaczące różnice i odchylenia od tych pozycji, które omówiono szczegółowo w dalszej części.,
spektrum absorpcji w podczerwieni MP-AU (czerwony), CT-AU (zielony), BK-AU (niebieski) wraz ze spektrum przeciętnego zdrowego moczu od 28 uczestników (czarny) w obszarze odcisków palców. Rysunek wlotowy pokazuje te same widma w regionie 3800-2500 cm-1.
wszystkie widma mają wspólne cechy w regionie wyższych częstotliwości (4000-2500 cm−1) (rys. 3-wlotowy)., Dwie najwyższe absorbancje, skupione wokół 1600 cm-1 i 1445 cm-1, wynikają głównie z mocznika, przy stosunkowo niewielkim udziale kreatyniny. Niewielkie różnice w absorbancji AUs wynikają głównie z różnic w stężeniu mocznika w odpowiednich preparatach. Z drugiej strony, region między 1200 cm – 1 i 800 cm−1 wykazuje znaczne różnice. Największą różnicą jest absorbancja przy 975 cm – 1 w BK-AU (rys. 3). W tej pozycji wszystkie widma AU mają różną liczbę pików w różnych pozycjach., Region ten jest zbiorem szeregu pików pochodzących głównie z mocznika, kwasu moczowego, kreatyniny i fosforanu sodu (rys. 1 i dodatkowe rys. S2). Dlatego niewielkie różnice w stężeniu tych związków dają bardzo inny profil w widmie.
Główna analiza składowa (PCA) służy do różnicowania trzech średnich widm moczu sztucznego w stosunku do przeciętnego moczu ludzkiego w całym obszarze fal (4000-600 cm−1) (rys. 4A). Pierwszy główny składnik (PC1) (72,7%) i drugi główny składnik (PC2) (19.,5%) stanowią 92% całkowitej wariancji. Wykres punktowy pokazuje, że MP-AU wykazuje większe podobieństwo do przeciętnego moczu ludzkiego w porównaniu z innymi preparatami AU, gdy bierze się pod uwagę całe widmo. Analiza ta jest również stosowana do wszystkich trzech pomiarów AUs i do wszystkich pomiarów moczu ludzkiego 28 zdrowych osób. 1400-1200 cm-1 (rys. 4B) i 1000-800 cm-1 (rys. 4C). W obu regionach MP-AU jest bardziej skuteczne w naśladowaniu cech widmowych ludzkiego moczu., Podczas gdy BK-AU jest bardziej skuteczny w porównaniu z CT-AU w regionie 1400-1200 cm-1, jest odwrotnie w regionie 1000-800 cm-1. Które pasma lub związki odpowiadają za te różnice omówiono w poniższych sekcjach.
wykres punktowy analizy głównych składników zastosowany do średnich spektrum moczu ludzkiego (HU) i pomiarów moczu sztucznego. Wykres porównuje widma w pełnym zakresie fal (4000-600 cm-1) (A)., Wykres punktowy wszystkich pomiarów IR w porównaniu z 1400 cm-1 Zakres (B) i 1000-800 cm-1 Zakres (C).
porównanie moczu u ludzi i MP-AU
po porównaniu absorpcji (ślad szary) i drugiego profilu pochodnego (ślad czerwony) występuje zadowalające dopasowanie widma MP-AU i moczu u ludzi (rys. 5A, B). Dwa widma nie różnią się znacząco na poziomie 0,05 na podstawie testu Manna-Whitneya (z = -1) (tabela uzupełniająca S3). Obszar pomiędzy 1800-1400 cm-1 jest prawie powszechny, co sugeruje drugi profil Pochodny., Jednak szczyt przy 1390 cm-1 jest inny. Wchłanianie (szary ślad) w tym momencie W MP-AU nie jest tak wysokie, jak w moczu. Wchłanianie to wynika z obecności cytrynianu sodu (rys. 1 I Tabela uzupełniająca S2). Chociaż ilość cytrynianu jest średnią wartością zakresu fizjologicznego, niedopasowanie może wskazywać na dużą ilość cytrynianu u ochotników. Stężenie cytrynianu w moczu może się różnić w zależności od diety., Na przykład w diecie typu DASH (dietetyczne podejście do zatrzymania nadciśnienia) (bogatej w warzywa, owoce, produkty pełnoziarniste, produkty o niskiej zawartości lipidów, ryby, mięso, orzechy i fasola; ograniczone w czerwonym mięsie, owocach słodzonych cukrem, napojach i tłuszczach) ilość cytrynianu zwiększa się w moczu37.
szczyty 1343, 1301, 1278 i 1242 cm-1 są prawie takie same w pozycji (rys. 5B-szary ślad) i pod względem względnego stosunku amplitud, z tym że pik przy 1301 cm-1 jest mniej widoczny od widma absorbancji. MP-AU zapewnia najlepsze dopasowanie w tym regionie 1350-1200 cm-1 w porównaniu z innymi AUs., W obszarze 1200-1000 cm−1, zamiast szczytu 1031 i 1045 cm−1 w ludzkim moczu (rys. 5A-czerwony ślad), jest jeden szczyt na 1039 cm-1 W MP-AU (rys. 5B-czerwony ślad). Dopasowanie spektralne między dwoma widmami w regionie 1000-600 cm-1 jest zadowalające. Jedną z różnic jest pozycja 928 cm-1 w widmie absorpcji moczu. Pasmo to znajduje się na wysokości 922 cm-1 W MP-AU. Po zbadaniu drugiego profilu pochodnego pik ten jest postrzegany jako superpozycja dwóch pików. Głównym czynnikiem przyczyniającym się jest pik w 929 cm−1, z niewielkim udziałem innego piku w 916 cm−1 w spektrum moczu., Jednak w MP-AU Amplituda absorpcji 929 cm−1 jest niższa, co przesuwa położenie koperty w dół do 922 cm-1. Może to być spowodowane bogatą zawartością ludzkiego moczu dostarczającego dodatkowych absorberów na 929 cm-1, które nie są zawarte w MP-AU.
porównanie moczu u ludzi i CT-AU
obszar widma absorbancji 1800-1400 cm−1 jest bardzo podobny do widma moczu w tym samym regionie, co jest głównie skorelowane z zawartością mocznika (rys. 5A, C). Widmo CT-AU jest również skuteczne w dopasowaniu ramienia na 1390 cm-1., Normalny zakres fizjologiczny cytrynianu wynosi 0,2-1,2 g/d31. W preparacie CT-AU ilość cytrynianu odpowiada 2 g / d (przy założeniu 1,5 L oddawania moczu na dobę), co jest większe niż maksymalny punkt zakresu fizjologicznego. Wydaje się, że średnie widmo moczu odzwierciedla ogromną ilość cytrynianu, jak wskazano w poprzedniej sekcji. Gdy porównuje się cały obszar palca w widmie CT-AU z widmem moczu ludzkiego za pomocą testu Manna-Whitneya, na poziomie 0,05 dwa widma różnią się znacząco (z = -13,5) (tabela uzupełniająca S4).,
w widmie moczu człowieka, pasmo 1238 cm−1 jest postrzegana jako znajduje się w 1246 cm−1 w widmie CT-AU (rys. 5c-czerwony ślad). Pozostaje jednak niejasne, czy oba pasma odzwierciedlają drgania tej samej grupy molekularnej, czy też są niezwiązanymi ze sobą absorbcjami. Ludzki mocz ma wiele absorpcji w regionie 1200-1000 cm-1. Chociaż większość składników jest wspólna między moczem i CT-AU, istnieją znaczne różnice pod względem względnych proporcji pasm, a tym samym ogólny profil jest inny., Pozycje szczytowe są na ogół podobne, z wyjątkiem tego, który znajduje się na 1045 cm−1 w spektrum moczu, który znajduje się na 1050 cm−1 w CT-AU. Ponadto w widmie CT−AU brakuje piku 1031 cm-1. Największa różnica amplitudy wynosi 1107 i ~1070 cm−1. Niewystarczająca ilość związków fosforanowych, kreatyniny i kwasu moczowego mogła przyczynić się do wystąpienia różnic w tych położeniach. Region jest superpozycją wielu grup wibracyjnych występujących w różnych formacjach molekularnych, takich jak lipidy, białka, glukoza i jej pochodne oraz kwasy nukleinowe., Dlatego dopasowanie spektrum AU do spektrum ludzkiego moczu jest prawie niemożliwe w tym regionie 1200-1000 cm-1. Inną ważną różnicą jest szczyt 965 cm−1 obserwowany w CT-AU, ale nie w widmie moczu u ludzi. Nie mamy wystarczających danych, aby omówić możliwą przyczynę tego pasma, ponieważ żaden ze składników moczu, które mierzyliśmy, nie wchłania się w tej pozycji. Ostatnim punktem w porównaniu CT-AU z ludzkim moczem jest brak pików 928 i 866 cm−1 w CT-AU.,
porównanie moczu u ludzi i BK-AU
ogólny profil widmowy BK-AU jest również podobny do moczu u ludzi w wielu punktach (rys. 3). Trzy najwyższe chłonności w pozycjach 1657, 1609 i 1447 cm-1 w widmie moczu ludzkiego odpowiadają pod względem ogólnego wyglądu, ale nieznacznie różnią się w pozycji szczytowej w widmie BK-AU (rys. 5A, D-szare ślady). Jednak szczyt 1491 cm−1 (postrzegany jako ramię na szczycie 1446 cm-1 w widmie absorbancji) jest bardziej wyraźny w BK-AU. Tę pozycję można przypisać kreatyninie (rys. 1 I Tabela uzupełniająca S2)., Ilość kreatyniny zastosowana w preparacie BK-AU mieści się w normalnym zakresie fizjologicznym, chociaż jest mniejsza niż średnia. W rzeczywistości ilość kreatyniny w preparacie MP-AU jest większa, ale absorbancja przy ~1490 cm-1 jest mniejsza. Dlatego tak wyraźnego szczytu nie można wytłumaczyć ilością kreatyniny. Z drugiej strony zaobserwowaliśmy wzrost amplitudy w tym miejscu, gdy siarczan sodu jest dodawany do roztworu podczas przygotowywania MP-AU, chociaż siarczan sodu nie ma absorbancji w tym regionie. Siarczan magnezu nie powoduje tego efektu., Opierając się na tym doświadczeniu, uważamy, że zwiększona absorbancja przy ~1490 cm−1 jest związana z ilością sodu w preparacie BK-AU. Całkowite stężenie sodu stosowane w preparacie BK-AU wykracza poza zakres fizjologiczny i jest maksymalne wśród trzech AUs. Szczegółowe porównanie zawartości substancji chemicznych przedstawiono w następnej sekcji.
niedopasowanie profili spektralnych między BK-AU A moczem jest widoczne przy ~1390 cm−1 (rys. 3). Amplituda w tej pozycji jest bardziej w widmie moczu. Szczyt ten przypisywano cytrynianowi w poprzednich odcinkach., Jednak wiele trybów wibracyjnych C-H absorbuje również w tym regionie, np. symetryczny tryb deformacji grupy metylowej przy 1380-1390 cm-138,39. W ludzkim moczu istnieje wiele źródeł CH3 wraz z kreatyną1, takich jak 3-Metylohystydyna, kwas octowy, aceton, kwas alfa-Hydroksyizomasłowy, 5-metylo-2-heksanon itp. które przyczyniają się do absorpcji przy 1390 cm-1. Brak takich związków mógł skutkować niższą amplitudą przy 1390 cm-1.
szczyt 1345 cm−1 w widmie moczu człowieka znajduje się na 1341 cm−1 w widmie BK-AU (rys. 5A, d-czerwone ślady)., Zespół ten pochodzi głównie z mocznika( 1331 cm-1), kwasu moczowego (1346 cm−1) i kreatyniny (1333 cm−1) i otrzymuje niewielki wkład z cytrynianu sodu (tabela uzupełniająca S2). W preparacie BK-AU stężenie mocznika mieści się w pierwszej 20% porcji normalnego zakresu fizjologicznego, co jest znacznie mniejsze niż średnia wartość. Stężenia kwasu moczowego i kreatyniny są również mniejsze niż średnie, tj. odpowiednio 13,5% i 33,5% porcji., Różnica w położeniu pasma wynika z różnych proporcji tych składników względem siebie, tak że nałożony zespół jest lekko przesunięty w miejscu. Inną różnicą w widmie BK-AU jest szczyt położony na 1246 cm-1 (rys. 5D). W widmie moczu ludzkiego szczyt ten znajduje się na wysokości 1238 cm-1. Niestety, nie jest jasne, czy oba pasma pochodzą z tej samej grupy molekularnej i zachodzi zmiana położenia, czy też oba pasma pochodzą z różnych grup molekularnych. Ten sam pik obserwuje się również w CT-AU, jak wspomniano wcześniej., Dodatkowo problem w obszarze 1200-1000 cm−1 obserwowanym w CT-AU obserwuje się również w BK-AU. Jak wspomniano wcześniej, idealne dopasowanie w tym oknie spektrum jest prawie niemożliwe ze względu na liczbę składników niezbędnych do ekonomicznego AU.
największą różnicą w widmie BK-AU jest stosunkowo nadmierna absorpcja przy ~975 cm−1. Pasmo to jest superpozycją pięciu różnych składników w 999, 984, 963, 945 i 909 cm-1, co ujawnia drugi profil Pochodny widma., Podobny pik obserwuje się również w CT-AU przy 965 cm-1, ale Amplituda pasma jest znacznie mniejsza niż w widmie BK-AU. W zakresie 940-1020 cm−1 wchłaniają się wodorowęglany, wodorofosforan di-sodu i mocznik (rys. 1 i dodatkowe rys. S3). Gdy poszczególne widma absorpcyjne tych trzech związków są dodawane (dodatek widmowy), otrzymana Amplituda w odpowiednim regionie jest znacznie mniejsza niż obserwowana w BK-AU. Świadczy to o powstawaniu związku między składnikami.,
u BK−AU, podobnie jak u CT-AU, w widmie moczu brakuje piku 866 cm-1. Ostatnia różnica między dwoma widmami wynosi 841 cm-1 w widmie BK-AU. Szczyt ten jest bardziej wyraźny w widmie BK-AU w stosunku do widm ct-AU i moczu ludzkiego. Wynika to głównie z kreatyniny (842 cm−1). Siarczan magnezu przyczynia się również do punktu odniesienia, dając opasce jego ostateczną pozycję i profil, o ile zaobserwowaliśmy podczas naszych eksperymentów., W BK – i CT-AU wodorowęglan absorbuje również przy 832 cm−1, co przyczynia się do amplitudy, ale nie zmienia położenia piku 841 cm−1.
w całym regionie odcisków palców widmo BK-AU i moczu u ludzi znacznie się różni na poziomie 0,05 na podstawie testu Manna-Whitneya (z = -10,8) (tabela uzupełniająca S5).
porównanie sztucznych moczu pod względem zawartości chemicznej
lista substancji chemicznych stosowanych we wszystkich trzech AUs jest zasadniczo taka sama, jednak stężenie każdego składnika jest inne (tabela uzupełniająca S1)., Na rysunku 6 przedstawiono ilość każdego składnika w stosunku do jego normalnego zakresu fizjologicznego31. MP-AU składa się z trzynastu składników, każdy na poziomie 50%, co jest średnią z normalnego zakresu fizjologicznego. Wartość ujemna na rysunku oznacza niewystarczającą ilość odpowiedniej substancji chemicznej. Skład chemiczny preparatu CT-AU ma braki. Po pierwsze, ilość cytrynianu przekracza normalny zakres (~125%). W tej samej żyle ilość wapnia i chlorków jest większa niż średnie wartości, odpowiednio 90% i 64%., Podczas gdy kreatynina i fosforany są niewystarczające, ilość mocznika, kwasu moczowego, amonu, magnezu i siarczanu są zbliżone do wartości minimalnych norm. W postaci BK-AU ilość sodu, wapnia i chlorku jest większa niż średnie wartości, odpowiednio 87%, 75% i 76%. Z drugiej strony mocznik, kwas moczowy, potas, magnez, siarczan i fosforan są znacznie mniejsze niż średnia z normalnego zakresu fizjologicznego. Chociaż związki te nadal mieszczą się w normalnym zakresie dla zdrowego człowieka, ilość szczawianu jest niewystarczająca.,
względna ilość wspólnych związków używanych we wszystkich AUs. Oś pozioma reprezentuje procent molarności normalnego zakresu fizjologicznego dla każdego związku. Wszystkie wartości normalnego zakresu są znormalizowane tak, że minimalny punkt normalnego zakresu jest ustawiony na 0%, a maksymalny punkt normalnego zakresu odpowiada 100%.