Discovery of SmacCas9
aby zmodyfikować ancestral 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) specyficzność Pam SpyCas9, wczesne i ostatnie raporty wykorzystywały ukierunkowaną ewolucję (np. warianty nrnh) lub racjonalne projektowanie oparte na strukturze krystalicznej (np. warianty „QQR”, „NG” i „nr”) 17,18,19,20,21,22. Raporty te koncentrowały się na kontaktujących z PAM resztach argininy R1333 i R1335, które znoszą funkcję, gdy są wyłącznie zmutowane., Podczas gdy badania te zidentyfikowały mutacje kompensacyjne skutkujące zmienioną swoistością Pam, produkowane przez nich warianty Cas9 utrzymywały preferencję guaniny w co najmniej jednej pozycji sekwencji PAM dla opisanej edycji in vivo. Równoczesne raporty wykorzystywały informacje ewolucyjne do dalszego rozluźnienia kanonicznej 5\(^{\prime}\)-nngrrt-3\(^{\prime}\) specyficzności Pam Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) lub do odkrycia alternatywnej 5\(^{\prime}\)-nnnncc-3\(^{\prime}\) specyficzności Pam do kanonicznej 5\(^{\prime}\)-NNNGHTT-3\(^{\prime}\) Pam Neisseria meningitidis cas923,24., Nukleazy z obu tych nowych raportów nadal jednak preferują zawartość GC w co najmniej jednej pozycji sekwencji PAM. Naszym celem było zniesienie takich warunków wstępnych dotyczących treści GC za pomocą niestandardowego przepływu pracy opartego na bioinformatyce, który wydobywa istniejącą różnorodność PAM w genu Streptococcus 25. Korzystając z tej strategii, stwierdziliśmy, że SmacCas9 ma potencjał, aby znosić zmienioną specyficzność Pam spoza GC po dopasowaniu 115 ortologów SpyCas9 z UniProt (ograniczone do tych z większym niż 70% wynikiem w parze BLOSSOM62)., Po wyrównaniu okazało się, że SmacCas9 był jednym z dwóch bliskich homologów, wraz z Streptococcus mutans B112SM-a Cas9 (SmutCas9), posiadającym glutaminy w obu pozycjach wyrównanych do silnie konserwowanych arginin kontaktujących się z PAM (rys. 1a-b; rys. uzupełniający 2A). Wiadomo, że pozostałości argininy zdecydowanie preferują guaniny w krajobrazie interakcji aminokwas-zasada, o czym świadczy specyficzność 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) spycas9. Z drugiej strony pozostałości glutaminy preferencyjnie wiążą się z adeninami poprzez interakcję z główną krawędzią rowka26., Postawiliśmy więc hipotezę, że SmacCas9 w naturalny sposób koewoluował z koniecznymi mutacjami kompensacyjnymi, aby uzyskać nowe rozpoznanie Pam bogate w adeninę. Mała próbka wielkości 13 przekładek z odpowiadającej jej tablicy CRISPR genomu uniemożliwiła nam pewne wnioskowanie SMACCAS9 Pam in silico., Niemniej jednak, możliwość dla SmacCas9 wymagającego mniejszej zawartości GC w swoim PAM była wspierana przez podobieństwa sekwencji do wariantu „QQR”, który ma specyficzność 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\), w uzupełnieniu do domniemanego konsensusu at-rich Pam dla ramek pochodzących z fagów w tablicach CRISPR powiązanych z wysoce homologicznymi SmutCas9, które zostały zidentyfikowane przy pomocy naszego wcześniej opisanego rurociągu SPAMALOT i zgodne z wcześniejszymi przewidywaniami (rys. 1c; rys. uzupełniający 2B; rys. uzupełniający 3) 25,28.
wyrównanie sekwencji SpyCas9, jego wariantu QQR i SmacCas9. Krok w podkreślonej czerwonej linii oznacza połączenie spycas9 i SmacCas9 w celu zbudowania hybrydy SpyMac. Logo sekwencji (narzędzie Weblogo online) bezpośrednio pod wyrównaniem przedstawia zachowanie w 11 pozycjach wokół arginin Pam z SpyCas9., b organizacja domeny SpyCas9 zestawiona z kodowaną kolorami strukturą kierowanego RNA, związanego z celem SpyCas9 (PDB ID 5F9R). Dwie nici DNA są czarne z wyjątkiem segmentu magenta odpowiadającego PAM. Niebiesko-zielono-czerwona Mapa kolorowa jest używana do oznaczania domeny Cas9 PI i sekwencji dystansowej, aby wyróżnić struktury, które nadają specyficzność sekwencji i rozpowszechnienie kontaktów wewnątrz domeny w PI43. c logo sekwencji wygenerowane online (WebLogo), które zostało wprowadzone z domniemanych sekwencji Pam znalezionych w Streptococcus phage i związane z bliskimi homologami SmacCas9.,
Inżynieria i charakterystyka Pam spymac
przystąpiliśmy do empirycznego określenia preferencji Pam kilku ortologów paciorkowców, które zmieniają jeden lub oba krytyczne kontakty Pam. Opierając się na zademonstrowanych przykładach Pam-interaction domain (PID) i guide RNA (gRNA) o wzajemnej zgodności między blisko spokrewnionymi i aktywnymi ortologami Cas9, skonstruowaliśmy nowe warianty poprzez racjonalną wymianę regionu Pi katalitycznie „martwego” SpyCas9 (dSpyCas9) z tymi wybranych ortologów (rys., 2A-B) 29,30. Zmontowane warianty, w tym dspymaccas9 (zwany dalej dspymac), były oddzielnie kodowane do komórek E. coli, wraz z przewodnikiem RNA pochodzącym z S. pyogenes i 8-merową biblioteką Pam o jednolitej reprezentacji bazy w układzie genetycznym PAM-SCANR, ustanowionym przez Leenay et al.31. Układ reguluje reporterem Zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) proporcjonalnie do siły wiązania PAM. W związku z tym zebraliśmy populacje komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej (rys., 4) i Sanger uporządkował je wokół miejsca Pam, aby określić preferencje bazowe w zależności od pozycji w rozpoznaniu Pam odpowiedniego wariantu. dSpyMac, bardziej niż dSpyMutCas9, wygenerował profil śladowy, który był najbardziej zgodny z niezależnym od guaniny rozpoznawaniem PAM, wraz z dominującą specyficznością dla dinukleotydów adeninowych (rys. 2a; rys. uzupełniający 2C).
Chromatogramy reprezentujące wzbogacenie oparte na PAM-SCANR sekwencji rozpoznających warianty Pam z biblioteki 5\(^{\prime}\)-nnnnnnn-3\(^{\prime}\). b SYBR-barwione żele agarozowe wykazujące in vitro trawienie substratów 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) po 16 minutach inkubacji z 100 nM oczyszczonych zespołów enzymu rybonukleoprotein. Strzałki odróżniają Pasowanie produktów rozszczepionych od niezszczepionego podłoża(górny pas)., Wykresy macierzy podsumowują obliczenia frakcji rozszczepionej, które zostały przeprowadzone w niestandardowym skrypcie do przetwarzania obrazów żelowych. Próbki wykonano w niezależnych duplikatach biologicznych (n = 2). c pomiary przebiegu czasowego rozszczepienia docelowego substratu DNA dla SmacCas9 i SpyMac. 1:1, 1:1 i 4:1 stosunek molowy rybonukleoproteiny do celu dla dzikich SpyCas9 i hybrydowych SpyMac. Dane źródłowe są dostarczane jako plik danych źródłowych.,
następnie oczyściliśmy enzymy aktywne nukleazami, aby kontynuować badanie potencjału rozpoznawania celów DNA i wyjątkowości SpyMac. (Dodatkowe Rys. 5A) 27,32. Indywidualnie inkubowaliśmy enzymy kompleksu rybonukleoproteinowego (złożone z Cas9 + crRNA + tracrRNA) z dwuniciowymi substratami docelowymi wszystkich 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prime}\)-sąsiadujące kombinacje zasad w dinukleotydzie adeninowym PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); rys. 2b)., Krótkie 16-minutowe trawienie wskazywało zarówno na dziki Typ SmacCas9, jak i Hybrydowy SpyMac rozszczepiony w sąsiedztwie 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) motywów szerzej i równomierniej niż poprzednio podany wariant QQR. SpyMac wyróżnił się dodatkowo szybkimi szybkościami cięcia DNA, które przypominają szybką kinetykę trawienia SpyCas9 (rys. 2c-d) 33. Przeprowadziliśmy reakcje, w których zastosowano różne długości dystansowe crRNA i sekwencję tracrRNA, ponieważ ta ostatnia różni się nieznacznie między genomami S. macacae i S. pyogenes(dodatkowe rys. 5B-E)., Żaden z tych dwóch parametrów Nie zrekompensował wolniejszego tempa rozszczepienia SmacCas9, ale zauważyliśmy marginalną poprawę w aktywności postaci typu dzikiego z jej natywnym tracrRNA, który komportuje się z interfejsem interakcji guide-Cas9, który jest głównie poza domeną PI.
edycja genomu za pomocą iSpyMac
Analiza Indel CRISPResso2 po NGS amplifikowanych regionów genomicznych w celu oceny edycji ispymac w porównaniu do SpyMac i SpyCas9, na wskazanych 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\) i 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\Prime}\) sekwencje Pam. Próbki przeprowadzono w dwóch niezależnych replikatach transfekcji (n = 2). b Efficiency heatmap of mismatch tolerance assay on genomic targets., Kwantyfikowane częstotliwości indel, ocenione algorytmem TIDE 41, są wykazywane dla każdego oznaczonego pojedynczego lub podwójnego niedopasowania w sekwencji sgRNA dla wskazanego wariantu Cas9 i wskazanej sekwencji PAM. Próbki przeprowadzono w dwóch niezależnych replikatach transfekcji (n = 2). c CRISPResso2 Genomic base editing analysis following NGS of genomic amplicons to assess conversion of cytosines to thymines by iSpyMac-BE3. Próbki przeprowadzono w dwóch niezależnych replikatach transfekcji (n = 2). Wszystkie dane źródłowe są dostarczane jako plik danych źródłowych.,
następnie oceniliśmy tolerancję ispymac na niedopasowane sekwencje, stosując sgRNAs ukrywające podwójne lub pojedyncze niedopasowanie do stałego protospacera w genie aavs, posiadającego sekwencję PAM 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\). ispymac wykazał możliwości edycji na obiektach z pojedynczymi niedopasowaniami w obrębie Pam-bliższego segmentu sgRNA., Aby złagodzić tę rzekomą skłonność do wyizolowania poza cel, wprowadziliśmy mutację R691A, która została wcześniej wyizolowana poprzez selekcję bakteryjną dla SpyCas9, aby utrzymać wysoką aktywność na celu, jednocześnie zmniejszając edytowanie poza celem35. Nasz wariant Wysokiej Wierności, HiFi-iSpyMac, wykazywał prawie znikomą aktywność na niedopasowanych sekwencjach, w porównaniu do oryginalnego enzymu, przy minimalnej utracie aktywności na celu (rys. 3b).,
na koniec wybraliśmy okno czterech nukleotydów w locus VEGFA w kontekście sekwencji, tak aby jakakolwiek inna endonukleaza CRISPR z zgłoszonym użyciem do edycji zasady nie pozwalała na edycję ich zasady za pomocą enzymu z deaminazą cytydynową36. W związku z tym kootransfektowaliśmy komórki HEK293T z formą niklową iSpyMac pochodzącą z wcześniej opisanej architektury BE3 dla edycji Zasady cytozyny (ISPYMAC-BE3) i plazmidem sgRNA celującym w Pam w dół wybranych nukleotydów5., Zmierzyliśmy efektywne poziomy edycji zasad w zebranych komórkach, które wykazywały ponad 20% konwersję cytozyny do tyminy w tych pozycjach za pomocą analizy NGS (rys. 3c).