Wat is Polyacrylamide Gel elektroforese (PAGE)?

elektroforetische technieken scheiden geladen moleculen in een elektrisch veld. De mobiliteit van een molecuul is omgekeerd evenredig aan zijn grootte en direct evenredig aan zijn last. Tijdens elektroforese, bewegen de proteã NEN zich naar een tegengesteld geladen elektrode in een elektrisch gebied.,

De snelheid van hun beweging in een elektroforetisch systeem wordt bepaald door verschillende factoren zoals temperatuur, pH en bufferconcentratie naast intrinsieke eigenschappen zoals de grootte, lading en vorm van de eiwitten.

elektroforetische scheiding van eiwitten strikt op basis van hun molecuulgewicht is alleen mogelijk als de lading van alle eiwitmoleculen tot hetzelfde teken kan worden gemanipuleerd. In een dergelijk geval, zal de mobiliteit van de eiwitmoleculen uitsluitend afhankelijk zijn van hun grootte.,

Polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) is een techniek die op dit idee wordt gebaseerd en wordt gebruikt om proteã nen op basis van hun grootte te scheiden.

principes van PAGE

In PAGE wordt een anionisch detergens, natriumdodecylsulfaat (SDS) genoemd, gebruikt om aan eiwitten te binden en deze een negatieve lading te geven. De proteã nen worden dan elektroforetisch volgens hun grootte gescheiden gebruikend een gelmatrijs van polyacrylamide in een elektrisch gebied wordt gemaakt.

Polyacrylamide wordt geproduceerd als gevolg van de polymerisatiereactie tussen acrylamide en N,N’-methyleenbisacrylamide (BIS) met behulp van een katalysator., De mate van polymerisatie of cross-linking kan worden geregeld door de concentratie van acrylamide en BIS aan te passen.

hoe meer de cross-linking, hoe harder de gel. De hardheid van het gel, op zijn beurt, moduleert de wrijving die door macromoleculen wordt ervaren wanneer zij door het gel tijdens pagina reizen, waarbij de resolutie van scheiding wordt beà nvloed.

Losse gels (4-8% acrylamide) zorgen ervoor dat moleculen met een hoger molecuulgewicht sneller door de gel migreren, terwijl harde gels (12-20% acrylamide) de migratie van grote moleculen beperken en selectief kleine moleculen door de gel laten bewegen.,

SDS-PAGE protocol

1. Monstervoorbereiding:

Eiwitmonsters worden gedenatureerd door ze te verwarmen met een detergens SDS en mercaptoethanol. Eerstgenoemde bindt sterk aan de proteã nen en geeft hen een hoge negatieve last terwijl laatstgenoemde sulfhydrylgroepen bevrijdt, waarbij polypeptidekettingen die een bovenmatige negatieve last en gelijkaardige Last aan massaverhouding dragen opleveren. Dit helpt de resolutie van proteã nen strikt gebaseerd op hun grootte tijdens gelelektroforese.

2., Gelpreparaat:

de elektroforetische gel bevat gewoonlijk verscheidene componenten, waaronder acrylamide, BIS en een buffer. Het mengsel wordt ontgast om belvorming tijdens polymerisatie van het gel te voorkomen. Ammoniumpersulfaat, een bron van vrije radicalen, en een stabilisator worden toegevoegd om polymerisatie te starten. BIS wordt ook toegevoegd om dwarsverbindingen tussen acrylamidemoleculen te vormen totdat uiteindelijk een gel wordt gevormd.

3. Elektroforese:

als een elektrische stroom wordt toegepast migreren eiwitten door de gel naar de positieve elektrode omdat ze een negatieve lading hebben., Elke molecule beweegt aan een verschillend tarief op zijn molecuulgewicht wordt gebaseerd-de kleine molecules bewegen sneller door het gel dan Grotere die. Migratie is meestal sneller bij hogere spanningen. Na een paar uur worden de eiwitmoleculen allemaal gescheiden door Grootte.

4. Kleuring en visualisatie:

zodra de elektroforese is voltooid, kan de gel worden gekleurd met behulp van gekleurde kleurstoffen zoals Coomassie Brilliant Blue of ethidiumbromide om de gescheiden eiwitten te laten verschijnen als verschillende gekleurde banden op de gel.

ongebonden kleurstof wordt uit de gel weggespoeld., De gekleurde gels worden vervolgens gedroogd zodat de kleurintensiteit van de eiwitbanden kan worden gemeten. De banden van radioactieve proteã nen kunnen door autoradiografie worden ontdekt. De proteã nen kunnen ook worden gekwantificeerd aangezien het eiwitgehalte direct evenredig aan de hoeveelheid van de gebonden kleurstof is.

sommige gelsystemen introduceren samen met het eiwitmonster een traceerkleurstof zoals broomfenolblauw – de zichtbare afstand die door de kleurstof op de gel wordt afgelegd, helpt bij het bepalen van de vereiste duur van elektroforese., Bromophenol blauw reist samen met de steekproefmolecules tot het uiteindelijk de bodem van het gel bereikt. De elektroforese moet op dit punt stoppen om geen eiwitmolecules te verzekeren elektroforese uit het gel en in de buffer.

verdere lezing

• alle Elektroforesegehalten
• elektroforese als hulpmiddel in Forensisch Onderzoek
• typen capillaire elektroforese