A De Identificatie van IS-elementen in E. coli
IS-elementen werden voor het eerst gedetecteerd door de effecten die werden veroorzaakt als deze elementen werden geïntegreerd in lac (Malamy, 1966, 1970) en gal-operons (Saedler en Starlinger, 1967a,b; Jordan et al., 1967; Adhya and Shapiro, 1969) van E. coli en in het vroege rechtsaf operon van zijn bacteriofaag lambda (Brachet et al., 1970)., De elementen veroorzaken een nulmutatie van het gen waarin zij integreren en een zeer sterk polair effect op alle genen van het operon dat distaal aan het gemuteerde gen wordt gevestigd. De mutaties keren spontaan terug naar het wilde type, maar de frequentie van reversie kon niet worden versterkt door mutagenen. Dit leidde tot het vermoeden dat de mutaties geen puntmutaties waren, maar DNA-herschikkingen.,
Er kon worden aangetoond dat de mutatie DNA aan het gal-operon toevoegde door de dichtheid van de transducerende lambda dgal-bacteriofaag te vergelijken die wel of niet de mutatie droeg en anderszins isogeen was (Jordan et al., 1968; Shapiro, 1969). Dit sloot de mogelijkheid uit dat de veranderingen door een inversie van DNA werden veroorzaakt. Om onderscheid te maken tussen de twee resterende mogelijkheden, duplicatie van een deel van het gal-operon of invoeging in dit operon van ongerelateerde DNA, Michaelis et al., (1969) vergeleek gemuteerde en niet-gemuteerde DNA door RNA te kruisen dat van de mutant aan of DNA wordt getranscribeerd. Deze experimenten toonden duidelijk aan dat het extra DNA gevonden in de mutanten niet afkomstig was van het gal operon. Bovendien zou kunnen worden aangetoond dat het extra DNA in twee onafhankelijke mutanten op zijn minst sommige van deze opeenvolgingen deelde. Dit verhoogde de mogelijkheid dat de mutanten niet werden veroorzaakt door het inbrengen van willekeurige segmenten van E. coli DNA, maar eerder door de transpositie van specifieke transposeerbare elementen.,
deze hypothese bleek waar te zijn, toen een groter aantal mutanten werd onderzocht door heteroduplex DNA moleculen in de elektronenmicroscoop te plaatsen (Fiandt et al., 1972; Hirsch et al., 1972a, b; Malamy et al., 1972). Op dat moment konden vier verschillende elementen worden geïdentificeerd. Ze werden insertiesequenties (is) genoemd en werden achtereenvolgens IS1 tot en met IS4 genummerd. IS1 is ongeveer 0,8 Kb (kilobases) lang. De andere elementen hebben een lengte van ongeveer 1,5 Kb. Een vijfde element, IS5, van een vergelijkbare grootte (Blattner et al.,, 1974) en een groter element van iets meer dan 5 Kb, dat om historische redenen γ-δ wordt genoemd(Guyer, 1978), zijn sindsdien ontdekt, maar het aantal lijkt dicht bij de verzadiging van E. coli K12 te liggen.
binnen de grenzen van de elektronenmicroscoop delen de verschillende IS-elementen geen sequenties, terwijl verschillende isolaten van hetzelfde element identiek zijn. Natuurlijk sluit dit kleine sequentieverschillen tussen de laatste niet uit.,
hybridisatie van geschikte DNA – enkelvoudige strengen die alleen het is-element in complementaire vorm delen, gevolgd door vertering met enkelvoudige strengen-specifieke nucleasen maken de isolatie van IS-DNA in zuivere vorm mogelijk (Ohtsubo en Ohtsubo, 1976; Schmidt et al., 1976). De snelle ontwikkeling van DNA restrictie analyse en sequencing methoden hebben, inderdaad, de bepaling van de volledige sequentie van IS1 (Ohtsubo en Ohtsubo, 1978; Johnsrud, 1979), en IS2 (Ghosal et al., 1979a). De volgorde van IS4 is bijna voltooid op het moment van schrijven van dit hoofdstuk (R. Klaer et al., niet-gepubliceerde experimenten).,
DNA-DNA-hybridisatietechnieken zijn gebruikt om te zoeken naar de aanwezigheid van Is-elementen in het E. coli-chromosoom. IS1 en IS2 zijn aanwezig in respectievelijk 8 8 en 5 5 exemplaren (Saedler en Heiss, 1973). Het gebruik van Southern ‘ s het bevlekken techniek stond de nauwkeurige bepaling van het exemplaaraantal van IS3 in E. coli K12 , en van IS4 toe . Bovendien werd aangetoond dat sommige van de IS-elementen op het E. coli-vruchtbaarheidsplasmide F (Davison et al., 1975a), en op enkele R-factoren (Hu et al., 1975).,
van de IS-elementen is niet bekend dat ze genen coderen die in eiwitten worden vertaald, hoewel in het geval van IS1 de bekende DNA-sequentie de mogelijkheid van de vertaling in een (paar) peptide (s) van beperkte grootte niet uitsluit. De lengte van de elementen IS verhindert de vorming van grote proteã nen. De bekende effecten van Is-elementen zijn daarom beperkt tot de positie, waar ze zijn geïntegreerd, en tot aangrenzende DNA-sequenties in positie cis. Deze effecten worden in de volgende paragrafen beschreven.
sinds 1974 is een andere klasse van transposeerbare DNA-elementen beschreven., Ze worden transposons genoemd. In de regel, zijn zij groter dan elementen is en door gevolgen ontdekt die door proteã ne worden veroorzaakt die in transposondna worden gecodeerd. De eerste beschreven transposons coderen resistentie tegen antibiotica, en de meeste bekende transposons dragen resistentiegenen (Datta et al., 1971; Hedges en Jacob, 1974; voor recensies, zie Cohen, 1976; Kleckner, 1977). Er zijn echter transposons die een E. coli enterotoxine coderen (So et al., 1979), of genen voor lactose-fermentatie (Cornells et al., 1979)., Tn3 draagt niet alleen een gen voor β-lactamase, maar draagt ook genen die betrokken zijn bij het omzettingsproces (Heffron et al., 1977; Gill et al., 1978; Chou et al., 1979). Hetzelfde lijkt te gelden voor Tn5 (Berg et al., 1978).
Transposons worden in de natuur aangetroffen als Delen van plasmiden. De transpositie tussen plasmiden verklaart de variabiliteit die met betrekking tot veelvoudige drugresistentie van verschillende plasmiden wordt gevonden. In het laboratorium, is de omzetting in het genoom van bacteriofaag ontdekt evenals omzetting in het bacteriële chromosoom., Geen van de bekende transposons is echter een natuurlijk bestanddeel van het E. coli K12 chromosoom.
de literatuur over transposons breidt zich snel uit, en voor een beschrijving van de vele verschillende transposons die op het moment van schrijven van dit artikel bekend waren, wordt de lezer verwezen naar uitgebreidere beoordelingen van dit onderwerp.
alle tot nu toe onderzochte transposons hebben een gemeenschappelijke structuur: ze dragen een herhaalde DNA-sequentie op hun eindpunt, en unieke DNA-codering genen tussen deze herhaalde DNA-sequenties. In de meeste gevallen, zijn de herhaalde opeenvolgingen van DNA omgekeerd ten opzichte van elkaar., Hun grootte is variabel. In sommige transposons de omgekeerde herhalingen zijn ongeveer 1,5 Kb, en er is reden om te vermoeden dat deze sequenties zijn onafhankelijk transposable is elementen. In andere gevallen is het herhaalde DNA slechts ongeveer 0,15 Kb (bijv. Tn1-3, codeert ampicilline resistentie (Heffron et al., 1975; Kopecko and Cohen, 1975).
in het geval van Tn9, codeert resistentie tegen chlooramfenicol (McHattie and Jackowski, 1977), en Tn1681, codeert E. coli enterotoxine (So et al., 1979), de sequentie herhaald op de termini is IS1., In het laatste geval worden de twee kopieën van IS1 relatief ten opzichte van elkaar omgekeerd, terwijl in het eerste geval de twee kopieën van IS1 directe herhalingen zijn. Aangezien uit de DNA-opeenvolging van IS1 bekend is dat dit element zelf door kleine niet-overeenkomende DNA-herhalingen wordt beëindigd, wordt de algemene regel dat de eindpunten van transposons omgekeerde herhalingen zijn behouden zelfs voor Tn9. Inderdaad, in het geval van IS2 (Ghosal et al., 1979a) en IS4 (Habermann et al., 1979), worden omgekeerde herhalingen gevonden op hun eindpunten., Het algemene karakter van deze constatering kan zelfs impliceren dat deze omgekeerde herhalingen een rol spelen in het omzettingsproces.