dit materiaal gaat vergezeld van een presentatie over de eiwitstructuur en de principes achter denatureringsmonsters en discontinue gelelektroforese.
de scheiding van macromoleculen in een elektrisch veld wordt elektroforese genoemd. Een zeer gemeenschappelijke methode om proteã nen door elektroforese te scheiden gebruikt een discontinue polyacrylamidegel als steunmedium en natriumdodecylsulfaat (SDS) om de proteã nen te denatureren. De methode wordt genoemd natriumdodecyl sulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE)., Het meest gebruikte systeem wordt ook wel de laemmli methode genoemd naar het Verenigd Koninkrijk Laemmli, die als eerste een paper publiceerde waarin SDS-pagina werd gebruikt in een wetenschappelijke studie.
SDS (ook laurylsulfaat genoemd) is een anionisch detergent, wat betekent dat wanneer de moleculen opgelost zijn een netto negatieve lading hebben binnen een breed pH-bereik. Een polypeptideketen bindt hoeveelheden SDS in verhouding tot zijn relatieve molecuarmassa. De negatieve ladingen op SDS vernietigen het grootste deel van de complexe structuur van proteã nen, en worden sterk aangetrokken naar een anode (positief-geladen elektrode) in een elektrisch veld.,
polyacrylamidegel voorkomt dat grotere moleculen net zo snel migreren als kleinere moleculen. Omdat de last-aan-massaverhouding bijna hetzelfde is onder SDS-gedenatureerde polypeptiden, is de definitieve scheiding van proteã nen bijna volledig afhankelijk van de verschillen in relatieve moleculaire massa van polypeptiden. In een gel van uniforme dichtheid is de relatieve migratieafstand van een eiwit (Rf, de f als subscript) negatief evenredig met de log van zijn massa., Als de proteã nen van bekende massa gelijktijdig met onbekenden worden in werking gesteld, kan de verhouding tussen Rf en massa worden uitgezet, en de geschatte massa ‘ s van onbekende proteã nen.
Eiwitscheiding door SDS-PAGE kan worden gebruikt om de relatieve molecuulmassa te schatten, de relatieve abundantie van belangrijke eiwitten in een monster te bepalen en de verdeling van eiwitten over fracties te bepalen. De zuiverheid van eiwitsteekproeven kan worden beoordeeld en de vooruitgang van een fractionering of zuiveringsprocedure kan worden gevolgd., De verschillende het bevlekken methodes kunnen worden gebruikt om zeldzame proteã nen te ontdekken en om iets over hun biochemische eigenschappen te leren. De gespecialiseerde technieken zoals het westelijke bevlekken, tweedimensionale elektroforese, en peptide in kaart brengen kunnen worden gebruikt om uiterst schaarse genproducten te ontdekken, overeenkomsten tussen hen te vinden, en iso-enzymen van proteã nen te ontdekken en te scheiden.
molecuulmassa versus molecuulgewicht
molecuulmassa (symbool m) wordt uitgedrukt in Dalton (Da). Eén Dalton wordt gedefinieerd als 1/12 de massa van koolstof 12., De meeste macromoleculen zijn groot genoeg om kiloDalton (kDa) te gebruiken om moleculaire massa te beschrijven. Molecuulgewicht is niet hetzelfde als molecuulmassa. Het is ook bekend als relatieve molecuulmassa (symbool Mr, waarbij r is een subscript). Het molecuulgewicht wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de massa van een macromolecuul en 1/12 de massa van een koolstof-12-atoom. Het is een dimensieloze hoeveelheid.
wanneer de literatuur een massa in Da of kDa geeft, verwijst het naar molecuulmassa. Het is onjuist om molecuulgewicht (relatieve molecuulmassa) in Dalton uit te drukken., Niettemin vindt u de term molecuulgewicht die met Dalton of kiloDaltons wordt gebruikt in sommige literatuur, vaak met behulp van de afkorting MW voor molecuulgewicht.
polyacrylamidegel voor SDS-PAGE
veel systemen voor eiwitelektroforese zijn ontwikkeld, en apparaten die voor SDS-PAGE worden gebruikt, lopen sterk uiteen. De methodologie die op deze pagina ‘ s wordt gebruikt, maakt gebruik van de laemmli-methode. Verwijzing naar de laemmli methode in een materiaal en methoden sectie elimineert de noodzaak om de buffers, gieten van gels, apparaten, enz.te beschrijven., Tenzij het papier gebruik maakt van enige wijziging van de methode, de enige details van SDS-pagina die moeten worden gerapporteerd in een sectie methoden zijn procent totaal acrylamide (%T) in een gel, relatieve percentage en type crosslinker (%C), en misschien een verwijzing naar de gel afmetingen. We gebruiken een “mini-gel” systeem, met 3 1/4″ x 4 ” gelcassettes.
SDS-PAGE kan worden uitgevoerd op voorgegoten gels, waardoor de moeite en het risico van het werken met acrylamide worden bespaard. De volgende beschrijving is van toepassing op in de winkel vervaardigde giet-en loopapparatuur die veel goedkoper is dan in de handel verkrijgbare apparatuur., Naast kosteneffectiviteit, een voordeel van het maken van je eigen gels de eerste keer is een dieper begrip van het proces.
ongeacht het systeem moet voor de bereiding twee verschillende lagen acrylamide tussen glasplaten worden gegoten. De onderste laag (het scheiden, of oplossen, gel) is verantwoordelijk voor eigenlijk het scheiden van polypeptiden door Grootte. De bovenste laag (stapelen gel) omvat de monsterputten. Het wordt ontworpen om proteã nen in een steekproef tussen twee bewegende grenzen op te vegen zodat zij (gestapeld) in micrometerdunne lagen worden gecomprimeerd wanneer zij het scheidende gel bereiken.,