grenzen in diergeneeskunde

Inleiding

ongewervelde dieren omvatten ongeveer een miljoen diersoorten die zowel in zoölogische instellingen als in huishoudens worden gehouden waar ze met de hand worden gefokt als exotische huisdieren (1). Buikpotigen omvatten bijna 60.000 soorten zowel in het water als in het land levende weekdieren, voornamelijk slakken en slakken (1). De grote Afrikaanse landslak (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) is inheems in Oost-Afrika, maar het is een wijdverspreide invasieve soort in Azië, Oceanië, en meer recent in Amerika, waar het per ongeluk of doelbewust is geïntroduceerd als voedselbron en als huisdier. Het vrijkomen ervan in natuurlijke ecosystemen, agrarische en stedelijke gebieden heeft geleid tot ecologische, gezondheids-en landbouwbedreigingen (2, 3). De grote Afrikaanse landslak is een intermediaire gastheer voor verschillende parasieten waaronder Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp.,, en Fasciola hepatica (4, 5). Alle bovenstaande wormen, met uitzondering van A. abstrusus, kunnen ernstige ziekten bij de mens veroorzaken. De grote Afrikaanse landslak is de belangrijkste slakkensoort die verantwoordelijk is voor de wereldwijde verspreiding van A. cantonensis die menselijke eosinofiele meningoencephalitis veroorzaakt in Azië en Amerika (2, 6). Risicofactoren voor infectie bij mensen, huisdieren en in het wild levende dieren met die worminthparasieten omvatten de inname van rauwe of onvoldoende verhitte geïnfecteerde slakken of slakken, of voedsel dat besmet is met het slijm van geïnfecteerde slakken of slakken (4, 5, 7, 8).,

hoewel de Afrikaanse reuzenlandslakken tot de populairste slakken behoren die als huisdier worden gehouden en hun wereldwijde populariteit als exotische huisdieren snel groeit, zijn er slechts enkele onderzoeken uitgevoerd naar het voorkomen van hun parasieten in natuurlijke omstandigheden (2, 6, 9-11). Het doel van dit onderzoek was om het voorkomen van parasieten te onderzoeken in reuze Afrikaanse landslakken gefokt als huisdier in Zuid-Italië.,

materialen en methoden

algemene gegevens

in augustus 2018 werden drie pools verse fecale monsters van in totaal 60 reuzenslakken uit Afrika, bewaard in drie verschillende privéverzamelingen in Pozzuoli, Caserta en Napels (Italië), onderzocht op parasieten. Uit elke plaats kregen we een poel van uitwerpselen van 20 individuele slakken elk. De slakken in dit onderzoek hadden een mediane leeftijd van 1,6 jaar variërend van 0,2 tot 2 jaar en hadden geen eerdere anti-parasitaire behandeling gekregen., Slakken werden gevoed met verse groenten en fruit; daarnaast werd een calciumpoeder suppletie gegeven (Calcium, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Duitsland)werd twee keer per week. Alle dieren werden gefokt in Italië, in particulier bezit en als huisdier gehouden in vier binnenterraria van 60 × 30 × 45 cm groot, in groepen van 10-20 dieren (2 groepen van 20 slakken in Pozzuoli en Caserta en 2 groepen van 10 slakken elk in Napels)., Als substraat werd gebruik gemaakt van een organische turfgrond (organische Coco-turfgrond, e-Coco Products, Gloucestershire, UK), die voorheen warmtebehandeld was (100°C gedurende 30 min) en toen vrij was van parasieten en insecten.

diagnostische Procedures

aanvankelijk werden uit elk van de vier terrariums twintig gram verse uitwerpselen verkregen., Wanneer gepoolde uitwerpselen geanalyseerd door vers uitstrijkje, flotatie en Baermann test toonde positiviteit voor rhabditide nematoden, twee slakken van elk positief terrarium werden afzonderlijk ondergebracht in een steriele plastic doos, en hun uitwerpselen werden verzameld, onmiddellijk na de ontlasting, in een steriele 50 ml plastic buis. Het coprologische onderzoek voor samengevoegde en individuele monsters omvatte vers uitstrijkje, centrifugale flotatie (2 g uitwerpselen voor elke test) met een oplossing van suiker en formaldehyde (soortelijk gewicht 1,27) en Baermann-test (10 g uitwerpselen voor elke test)., Bovendien werd het slijm verkregen tijdens vers uitstrijkje onderzoek geanalyseerd onder een lichte microscoop. Omdat de larvale vormen van verschillende worminth soorten zich in de voetspier van slakken kunnen bevinden, werd histologisch onderzoek van biopsiemonsters uit de voorste en achterste delen van de voetspier uitgevoerd in 30 slakken, verdoofd met de techniek beschreven door Giannelli et al. (12) en Gilbertson en Wyatt (13)., De biopsiemonsters werden gefixeerd in 10% neutrale fosfaat-gebufferde formaline, en verwerkt door routinemethoden in paraffineblokken die in 3 µm dikke secties werden gesneden, en gekleurd met hematoxyline en eosine. Het onderzoek werd uitgevoerd onder toestemming van de praktijk waar het plaatsvond en onder ondertekende, schriftelijke geïnformeerde toestemming van de eigenaar.

morfologische identificatie

tijdelijke bevestigingen werden gemaakt door hittedodende nematoden op glasplaten in een druppel water, waarna een glasdop werd aangebracht., Nematoden werden overgebracht in een druppel leidingwater op een glasplaat en gedurende 10 s op een verwarmer (100°C) geplaatst. deze monsters werden gebruikt voor morfologische identificatie. Een AMPLIVAL lichtmicroscoop, Carl Zeiss Jena, en een Leitz Diaplan met Nomarski optica werden gebruikt voor observatie., Morfologische identificatie van rhabditide nematoden volgde op Andrassy (14) en Andrassy (15) en was voornamelijk gebaseerd op de morfologie van farynx en stoma, en voortplantingssysteem, voornamelijk de kenmerken van spicules, aantal en positie van papillen of aanwezigheid en grootte of vorm van bursa voor mannetjes; en staartvorm, positie van vulva en morfologie van voortplantingssysteem voor vrouwtjes. De identificatie van de larven was gebaseerd op de staartvorm.

moleculaire analyse

DNA werd geëxtraheerd uit nematode specimens verkregen uit feces gefixeerd in 96% ethanol verzameld op de drie plaatsen., Nematoden werden ‘ s nachts gewassen in dubbel gedestilleerd water (ddh2o), voorafgaand aan de moleculaire analyse, voor volledige verwijdering van reststoffen van ethanol. Elk afzonderlijk nematode werd overgebracht in een steriele Eppendorf-buis (200 µl) met 20 µl extractiebuffer (17,7 µl ddH2O, 2 µl 10 × geconcentreerde PCR-buffer, 0,2 µl 1% Tween 20 en 0,1 µl proteïnase K). Buffer en nematoden werden gedurende 20 minuten ingevroren bij -20°C en vervolgens gedurende 1 uur onmiddellijk geïncubeerd bij 65°C, gevolgd door 10 minuten bij 95 ° C., De lysaten werden gekoeld op ijs en vervolgens gecentrifugeerd (2 min, 9.000 g); 1 µl supernatant werd gebruikt voor PCR.

een fragment van rDNA dat de interne getranscribeerde spacergebieden bevat (ITS1, 5,8 S, ITS2) werd versterkt met primers 18S: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (vooruit), en 28S: 5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′ (achteruit) (16). Een fragment van rDNA dat het gen voor 18S rRNA bevat werd versterkt gebruikend primers 22F: 5 ‘- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3’ (voorwaartse), en 1080JR: 5 ‘- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3’ (omgekeerde) (17). De PCR master mix bestond uit: ddH2O, 7.,25µl; 10 × PCR-buffer, 1,25 µl; deoxynucleosidetrifosfaten (dNTPs), 1 µl; 0,75 µl van zowel forward als reverse primer; polymerase, 0,1 µl; en 1 µl DNA-extract. De PCR-profielen werden als volgt gebruikt: voor zijn 1 cyclus van 94°C gedurende 7 min, gevolgd door 35 cycli van 94°C gedurende 60 s, 50°C gedurende 60 s en 72°C gedurende 60 s, en een laatste rek bij 72°C gedurende 7 min (14); voor 18S 1 cyclus van 94°C gedurende 5 min, gevolgd door 35 cycli van 94°C gedurende 60 s, 55°C gedurende 90 s en 72°C gedurende 2 min en een laatste rek bij 72°C gedurende 10 min., De PCR-producten werden gesequenced door GATC Biotech (Duitsland) en later bewerkt en geüpload naar GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

resultaten

De Baermann-test toonde in alle monsters de aanwezigheid aan van nematodenlarven met een lengte van 170 tot 336 µm. Eieren, larven en volwassen rhabditide nematoden werden met verse uitstrijkings-en flotatiemethoden in alle fecale monsters gedetecteerd. Rhabditella axei (figuur 1) werd morfologisch geïdentificeerd uit twee van de drie gepoolde en individuele fecale monsters uit Pozzuoli en Napels. Daarnaast Rhabditis terricola, Cruznema sp. , en Pristionchus entomophagus werden geïsoleerd uit één zwembad en individuele fecale monsters van Caserta. Er werden geen parasieten gevonden in de spierbiopsiemonsters of in het slijm.

verschillende morfologische typen rhabditide nematoden werden geïsoleerd uit slakkenpoep, gefixeerd in 96% ethanol. Verkregen en bewerkte sequenties van ITS en 18S van deze nematoden werden vergeleken (BLAST) met het materiaal in GenBank en geïdentificeerd als R. axei (partiële 18S, toetredingsnummer MK124578, gelijkenis 99%), Rh., terricola (gedeeltelijke 18S en gedeeltelijke ITS1, Toelatingsnummer MK156052, gelijkenis 100%), P. entomophagus (gedeeltelijke 18S en gedeeltelijke ITS1, Toelatingsnummer MK156050, gelijkenis 99%) en Cruznema sp. (gedeeltelijke 18S en gedeeltelijke ITS1, toetredingsnummer MK156051, gelijkenis 96-100%).

discussie

de resultaten van deze studie tonen aan dat alle onderzochte Afrikaanse reuzenslakken eieren, larven en volwassen rhabditide nematoden in de ontlasting leggen en daarom een bron van infectie kunnen vormen voor andere huisdieren en mensen. Om verkeerde identificatie met Strongyloides sp.te voorkomen.,, een nematodesoort die nauw lijkt op rhabditiden en een duidelijke parasitaire zoönotische relevantie heeft (14, 15, 18), werd de initiële morfologische diagnose van rhabditide nematoden bevestigd door moleculaire analyses.

Rhabditidae omvatten vrijlevende saprofytische nematoden, die op grote schaal worden aangetroffen in de bodem en in organisch afval, waar ze zich voornamelijk voeden met bacteriën. Veel soorten slakken kunnen dienen als definitieve gastheren voor rhabditide nematoden (14, 15). Echter, een aantal Rhabditis en Rhabditella soorten is geassocieerd met gewervelde dieren, waaronder mensen (14, 15, 19-27)., Hoewel hun aanwezigheid het gevolg kan zijn van milieuverontreiniging, kunnen deze nematoden ziekten veroorzaken bij veel dieren en mensen. Rhabditis elongata, Rh. homini’ s en Rh. usuii-larven zijn geïsoleerd uit menselijke uitwerpselen, urine en vaginale wattenstaafjes (19-21). Niettemin zijn er niet veel gevallen van symptomatische infecties gemeld bij mensen (21-24). Feng en Li (25) beschreven twee menselijke gevallen van urine-infectie door R. axei in China, en Ahn et al. (20) rapporteerde vijf menselijke gevallen van darminfectie met Rhabditis sp. op het platteland school kinderen van Zuid-Korea., Evenzo werden in China twee gevallen van darminfectie bij de mens door R. axei beschreven (26), terwijl in een ander gepubliceerd werk (21) een geval van darminfectie werd gemeld bij een 5 maanden oud Braziliaans kind dat koorts en waterige en bloederige diarree kreeg; coprologisch onderzoek toonde eieren, larven en volwassenen van Rhabditis sp. Meamar et al. (27) beschreef het optreden van waterige diarree bij twee Iraanse patiënten met AIDS, geassocieerd met ernstige darminfectie door larven en volwassen exemplaren van R. axei. Tot slot, Teschner et al., (24) onlangs beschreven een geval van buitenste gehoorgang infectie bij een 37-jarige man gepresenteerd met purulente otorrhea van beide oren en acuut gehoorverlies veroorzaakt door Rhabditis sp. In het algemeen, Rhabditis spp. worden beschouwd als een veel voorkomende oorzaak van externe otitis bij runderen die in tropische gebieden (bijvoorbeeld, Zuid-Amerika en Afrika), met name in oudere dieren, en zijn ook geïdentificeerd in kippen, honden en varkens met incoercible diarree (18, 28-30). Echter, asymptomatische infecties zijn ook beschreven en deze nematoden worden vaak beschouwd als pseudoparasieten (28, 29).,

hoewel in alle fecale monsters vrij levende nematoden werden teruggevonden, werden er geen monsters gevonden in het slijm en histologische monsters. Een mogelijke verklaring voor deze bevinding is dat nematoden zich in verschillende weefsels/organen van hun gastheer kunnen bevinden, afhankelijk van het type associatie nematode/weekdier gastheer (15, 31, 32). Rhabditis spp. voltooi zijn levenscyclus in de slak, zonder schade aan de molluscan gastheer. Eerdere studies over de vrijlopende Afrikaanse slakken (Archachatina spp. en Achatina spp.) onthulde dat R., axei leeft in het maagdarmkanaal van zijn slakkenhost waar de volledige nematode levenscyclus is voltooid (31-33).

hoewel Afrikaanse reuzenslakken als gastheren voor R. axei worden vermeld, is het voorkomen van deze nematode slechts gemeld bij een paar andere soorten reuzenslakken dan A. fulica, namelijk Archachatina marginata ovum, Ar. marginata saturalis, en Achatina achatina (31). Aan de andere kant heeft P. entomophagus een wereldwijde verspreiding en is voornamelijk geassocieerd met mestkevers uit de superfamilie Scarabaeoidea (34, 35), R., terricola is gevonden in salamanders (14, 15) en Cruznema spp. in de krekel Gryllodes laplatae (Orthoptera) (36). In alle gevallen vindt overdracht van de parasiet plaats door het contact van de slakken met verontreinigde vochtige grond die rijk is aan ontbindend organisch materiaal (31, 37). Hoewel in de onderhavige gevallen alle dieren in terraria werden gehouden met een warmtebehandelde organische grond, vermoeden wij dat er vóór de aankoop van de dieren in de dierenspeciaalzaak of fokkerij besmetting kan hebben plaatsgevonden.,tot slot wijzen onze resultaten erop dat de Afrikaanse landslakken als huisdier kunnen dienen als reservoir van verschillende rhabditide nematoden. Deze slak is een van de meest gehouden als huisdier, en daarom vaak leven in de nabijheid van de mens. Hierdoor is de verontreiniging van de binnenlandse omgeving door hun uitwerpselen mogelijk. Hoewel parasitaire nematoden niet werden geïsoleerd in deze studie, de reuze Afrikaanse landslakken moeten nog steeds worden beschouwd als potentiële dragers van nematoden in staat om opportunistische ziekten bij de mens te veroorzaken., Daarom benadrukken we het belang van verder epidemiologisch onderzoek naar het voorkomen van vrijlevende en parasitaire nematoden in in gevangenschap gehouden buikpotige slakken, en benadrukken we de noodzaak van strikte controlemaatregelen om het risico van opportunistische infectie met rhabditide nematoden bij huisdierslakkenbezitters te verminderen.

Auteursbijdragen

Dd ‘ O en de lidstaten hebben de analyse ontworpen en gepland. De lidstaten en JN hebben de analyse uitgevoerd. CA hielp het onderzoek vorm te geven en bewerkte het manuscript. Alle auteurs gaven kritische feedback en droegen bij aan het uiteindelijke manuscript.,

belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relatie die als een potentieel belangenconflict kon worden opgevat.

PubMed Abstract / Google Scholar