gelelektroforese definitie
gelelektroforese is een procedure die wordt gebruikt om biologische moleculen op grootte te scheiden. De scheiding van deze molecules wordt bereikt door hen in een gel met kleine poriën te plaatsen en een elektrisch gebied over het gel te creëren. De molecules zullen sneller of langzamer bewegen op basis van hun grootte en elektrische last.,
gelelektroforese overzicht
het proces van gelelektroforese werkt omdat negatief geladen moleculen weg bewegen van de negatieve pool van de elektrische stroom en kleinere moleculen sneller bewegen dan grotere moleculen. Aldus, wordt een groottescheiding bereikt binnen de pool van molecules die door het gel lopen. De gel werkt op een vergelijkbare manier als een zeef die deeltjes door Grootte scheidt. De elektroforese werkt om de deeltjes, met behulp van hun inherente elektrische lading, door de zeef.,
wanneer onderzoekers proberen onderscheid te maken tussen verschillende segmenten van DNA, bijvoorbeeld, is het proces eenvoudig. De monsters worden geladen in kanalen aan het begin van de gel. Elke molecule van DNA heeft dezelfde lading (-1), omdat DNA door dezelfde 4 nucleotiden wordt gevormd en altijd een lichtjes negatieve lading draagt ongeacht zijn grootte. Daarom zal elke DNA-molecule dezelfde kracht hebben die het door het gel trekt.
echter, de grootte van elk molecuul belemmert zijn vooruitgang door de gel., Grote moleculen raken delen van de gelmatrix en worden vertraagd. De kleine molecules van DNA kunnen tussen de diverse componenten van de gelmatrijs uitglijden, en snel hun weg naar de andere kant van het gel maken. Na een bepaalde hoeveelheid tijd, kunnen de geverfde de molecules van DNA worden gezien die in verschillende gebieden van het gel samenvoegen, gebaseerd op hoe ver zij zich tijdens gelelektroforese bewogen. Dit staat onderzoekers toe om de segmenten te identificeren, en DNA van verschillende organismen te vergelijken.
waarvoor worden Gelelektroforeses gebruikt?,
Het doel van gelelektroforese is het visualiseren, identificeren en onderscheiden van moleculen die zijn verwerkt met een eerdere methode, zoals PCR, enzymatische spijsvertering of een experimentele aandoening. Vaak, worden de mengsels van nucleic zuren of proteã nen die van een vorig experiment/methode worden verzameld in werking gesteld door gelelektroforese om de identiteit te bepalen of tussen molecules te onderscheiden.,
Gel Elektroforese Stappen
De grote stappen die in een gemeenschappelijke DNA-gelelektroforese protocol:
de Voorbereiding van de monsters voor het uitvoeren
Het DNA is geïsoleerd en voorbewerkte (bijvoorbeeld PCR, enzymatische vertering) en in een oplossing met een aantal elementaire blauwe kleurstof te helpen visualiseren door de beweging van het monster door de gel.
een agarose – Tae-geloplossing wordt bereid
TAE-buffer levert een bron van ionen voor het opzetten van het elektrische veld tijdens elektroforese., De gewicht-tot-volume concentratie van agarose in TAE buffer wordt gebruikt om de oplossing te bereiden. Bijvoorbeeld, als een 1% agarose gel wordt vereist, wordt 1g agarose toegevoegd aan 100mL TAE. Het gebruikte agarosepercentage wordt bepaald door hoe groot of klein DNA wordt verwacht te zijn. Als men kijkt naar het scheiden van een pool van kleinere DNA-banden (<500bp), wordt een hoger percentage agarose gel (>1%) Bereid. Het hogere percentage van agarose leidt tot een dichtere zeef om de scheiding van kleine lengteverschillen van DNA te verhogen., De agarose-TAE oplossing wordt verhit om de agarose op te lossen.
gieten van de gel
De agarose Tae-oplossing wordt gegoten in een gietbak die, zodra de gel-oplossing is afgekoeld en gestold, een gelplaat met een Rij putjes aan de bovenkant creëert.
instellen van de elektroforesekamer
de vaste gel wordt in een met TAE-buffer gevulde kamer geplaatst. De gel wordt zo geplaatst dat de kamerputten het dichtst bij de negatieve elektrode van de kamer liggen.,
laden van de gel
De gelkamerputten worden geladen met de DNA-monsters en gewoonlijk wordt een DNA-ladder ook geladen als referentie voor groottes.
elektroforese
de negatieve en positieve uitgangen zijn verbonden met de kamer en met een voeding waar de spanning is ingesteld. Het aanzetten van de voeding stelt het elektrische veld op en de negatief geladen DNA-steekproeven zullen door het gel en vanaf de negatieve elektrode naar positief beginnen te migreren.,
het stoppen van de elektroforese en het visualiseren van het DNA
zodra de blauwe kleurstof in de DNA-monsters ver genoeg door de gel is gemigreerd, wordt de voeding uitgeschakeld en wordt de gel verwijderd en in een ethidiumbromide-oplossing gebracht. Ethidiumbromide intercaleert tussen DNA en is zichtbaar bij UV-licht. Soms wordt ethidiumbromide in Stap 2 rechtstreeks aan de agarosegeloplossing toegevoegd. De met ethidium bromide bevlekte gel wordt vervolgens blootgesteld aan UV-licht en er wordt een foto genomen. De banden van DNA worden gevisualiseerd binnen van elke steeg die met een kamer goed overeenkomt., De ladder van DNA die werd geladen wordt ook gevisualiseerd en de lengte van de banden van DNA kan worden geschat. In onderstaande figuur wordt een voorbeeld gegeven.
soorten gelelektroforese
Er zijn twee soorten gelelektroforese: native en denaturering. De inheemse gelelektroforese probeert gewoonlijk RNA of proteã ne in zijn inheemse structuur te houden terwijl het door het gel loopt., Het denatureren van gelelektroforese probeert RNA of proteã ne in zijn meest lineaire structuur vóór of tijdens gelelektroforese te verminderen.
de denaturatie van het RNA of eiwit wordt bereikt door toevoeging van een reductiemiddel aan het monster, de gel en/of de buffer. Het reductiemiddel scheidt banden binnen het RNA of eiwitmolecuul en vermindert daardoor zijn secundaire structuur. De secundaire structuur van een eiwit of RNA zal op een niet-lineaire manier beïnvloeden hoe snel het migreert door een gel., Een gedenatureerde, lineaire vorm van RNA of eiwit zal echter proportioneel migreren naar zijn lineaire grootte (basenparen of kilo Daltons). Het denatureren van gelelektroforese is vaak nauwkeuriger voor grootteidentificatie, terwijl de inheemse gelelektroforese gewoonlijk wordt gebruikt om grotere eiwitcomplexen te identificeren.
voorbeelden van gelelektroforese
- TAE Agarosegelelektroforese wordt het meest gebruikt voor DNA.
- TBE en denaturerende pagina (polyacrylamidegelelektroforese) komen vaak voor bij RNA-scheiding.,
- SDS PAGE is een denaturerende gelelektroforese die vaak wordt gebruikt voor eiwitidentificatie en-scheiding.