De Zwarte Dood van 1347-1351, veroorzaakt door de bacterie Yersinia pestis2,3, is een van de beste historische voorbeelden van een opkomende infectie met een snelle verspreiding en hoge mortaliteit, met een geschatte 30-50% van de Europese bevolking in slechts een periode van vijf jaar4. Discrepanties in epidemiologische trends tussen de middeleeuwse ziekte en moderne Y. pestis infecties hebben controverse ontketend over de aetiologische agent van de pandemie5,6., Hoewel oude DNA-onderzoeken Y. pestis2, 3 sterk hebben betrokken bij de oude pandemie, kunnen genetische veranderingen in de bacterie gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor verschillen in ziekteverschijnselen en ernst. Om de evolutie van het organisme te begrijpen is het noodzakelijk om de genetische veranderingen te karakteriseren die betrokken zijn bij de transformatie van een sylvatische pathogeen naar een ziekteverwekker die in staat is tot een pandemische infectie op de schaal van de Zwarte Dood, en om de relatie met momenteel circulerende stammen te bepalen., Hier beginnen we deze discussie met de presentatie van de eerste concept genoomsequentie van de oude ziekteverwekker.
Y. pestis is een recent geëvolueerde afstammeling van de in de bodem levende bacillus Yersinia pseudotuberculosis7, die in de loop van zijn evolutie twee extra plasmiden verwierf (pMT1 en pPCP1) die het voorzien van gespecialiseerde mechanismen voor het infiltreren van zoogdiergastheren. Om mogelijke evolutionaire veranderingen in een van deze plasmiden te onderzoeken, rapporteerden we over de screening van 46 tanden en 53 botten uit de East Smithfield collection van Londen, Engeland op aanwezigheid van de Y., pestis-specifieke pPCP1 (ref. 3). Historische gegevens geven aan dat de East Smithfield begraafplaats eind 1348 of begin 1349 specifiek werd opgericht voor het begraven van zwarte Doodslachtoffers8 (aanvullende Fig ‘ s 1 en 2), waardoor de collectie zeer geschikt was voor genetisch onderzoek van oude Y. pestis. DNA sequentiegegevens voor vijf tanden verkregen via moleculaire vangst van de volledige Y. pestis-specifieke pPCP1 onthulde een C tot T schade patroon karakteristiek voor authentieke endogene oude DNA9, en assemblage van de gepoolde Illumina reads toegestaan de reconstructie van 98,68% van de 9.,6-kilobase plasmide met ten minste een dubbele dekking3.
om de geschiktheid van op capture gebaseerde methoden voor de reconstructie van het volledige oude genoom te beoordelen, werden meerdere DNA-extracten van zowel wortels als kronen afkomstig van vier van de vijf tanden die de hoogste ppcp1-coverage3 opleverden gebruikt voor array-based enrichment (Agilent) en daaropvolgende high-throughput sequencing op het Platform10 van Illumina GAII. Verwijdering van duplicaatmoleculen en daaropvolgende filtering produceerde een totaal van 2.366.647 hoogwaardige chromosomale reads (aanvullende tabel 1a, b) met een gemiddelde fragmentlengte van 55.,53 basisparen (aanvullende Fig. 4), wat typisch is voor oud DNA. Dekkingsschattingen leverden een gemiddelde van 28.2 reads per plaats voor het chromosoom, en 35.2 en 31.2 voor de pcd1 en pmt1 plasmiden, respectievelijk (Fig. 1a, c, d en aanvullende tabel 1b, c). De dekking was voorspelbaar laag voor pPCP1 (Fig. 1e) omdat sondes specifiek voor dit plasmide niet werden opgenomen op de arrays. De dekking is gecorreleerd met het GC-gehalte (aanvullende Fig. 6), een eerder waargenomen trend voor gegevens met een hoge productiesequentie11., De dekking op elke helft van het chromosoom was ongelijk toe te schrijven aan verschillen in het rangschikken van diepte tussen de twee reeksen, met 36.46 en 22.41 gemiddelde leest per plaats voor Reeks 1 en reeks 2, respectievelijk. Hoewel een grotere diepte bijdroeg tot een meer gemiddelde leesfrequentie per locatie, nam de totale dekking niet toe, waarbij beide arrays 93,48% van de beoogde regio ‘ s besloegen met een minimum van één voudige dekking (aanvullende tabel 1b)., Dit geeft aan dat onze capture procedure met succes verkregen template moleculen uit alle genomische regio ’s toegankelijk via deze methode, en dat diepere sequencing niet zou resulteren in extra gegevens voor co92 template regio’ s niet behandeld in onze dataset.
a, c–e, Dekkingsgrafieken voor het chromosoom (a) en de plasmiden pMT1 (c), pCD1 (d) en pPCP (e). Dekking in blauw, GC-inhoud in groen., Schaallijnen geven aan 10-, 20-, 30-, 40- en 50-voudige dekking en 10%, 20%, 30%, 40% en 50% GC-gehalte. Voor plasmiden komt rood overeen met coderingsgebieden, geel met mobiele elementen. Chromosoom toont mediane dekking per gen. Plasmiden tonen elke site uitgezet. De dekkingsdistributies voor de plasmiden zijn weergegeven in aanvullende Fig. 5. b, De distributies tonen chromosomale dekking van array 1 (Blauw) en array 2 (Rood), die erop wijzen dat diepere het rangschikken het aantal leest per plaats verhoogt, maar de algemene dekking niet wezenlijk beà nvloedt.,
PowerPoint slide
Het is bekend dat de Genoomarchitectuur sterk varieert tussen de bestaande Y. pestis strains12. Om de genvolgorde in ons oude genoom te extrapoleren, analyseerden we reads mapping naar de co92 referentie voor alle extracten afkomstig van een enkel individu die de hoogste dekking opleverde (individu 8291). Ondanks de korte leeslengte van onze oude sequenties en de zeer repetitieve aard van het Y. pestis genoom, 2.221 contigs matching CO92 werden geëxtraheerd, bestaande uit een totaal van 4.367.867 bp., Om potentiële gebieden van het oude genoom te identificeren die architectonisch verschillend zijn van CO92, werden alle reads niet het in kaart brengen aan de co92-verwijzing beurtelings overwogen voor contig Bouw. Na filtering voor een minimumlengte van 500 bp, bleven 2.134 contigs bestaan uit 4.013.009 bp, waarvan 30.959 afkomstig waren van niet-in kaart gebrachte meetwaarden. Conventionele BLAST search bevraagd tegen de co92 genoom geïdentificeerd overeenkomsten voor 2.105 contigs. Bewijs van gewijzigde architectuur werd geïdentificeerd in 10 contigs (aanvullende tabel 2). Een voorbeeld van een dergelijke structurele variant wordt getoond in Fig., 2, waar referentie-geleide assemblage die unmapped leest om het breekpunt te overspannen zijn reconstructie valideert. Deze specifieke genetische oriëntatie wordt alleen gevonden in Y. pseudotuberculosis en Y. pestis stammen Mictrotus 91001, Angola, Pestoides F en B42003004, die voorouderlijk zijn voor alle Y. pestis gewoonlijk geassocieerd met menselijke infecties (tak 1 en tak 2 strains13,14). Verder wijzen discrepanties in de rangschikking van deze regio in Tak 1 en tak 2 moderne Y. pestis stammen erop dat herschikkingen plaatsvonden als afzonderlijke gebeurtenissen op verschillende geslachten.,
leest in kaart gebracht op posities a (blauw) en B (groen) zijn 231 kb uit elkaar in het linearized co92 genoom. De aangrenzende reeks is een hoge dekking, hoewel slechts 18× en 20× wordt weergegeven als gevolg van ruimtebeperkingen (zwart) voor respectievelijk A en B. De structurele variant werd geassembleerd met behulp van Leest die niet in kaart gebracht naar CO92 (rood)., Zijn positie wordt getoond op het linearized Microtus 91001 chromosoom waar 9,096 BP contig met 100% identiteit in kaart brengt.
PowerPoint slide
Single-nucleotide verschillen tussen ons oude genoom en de co92 referentie bestond verrassend genoeg uit slechts 97 chromosomale posities, en 2 en 4 posities in de pcd1 en pmt1 plasmiden, respectievelijk (aanvullende tabel 3), wat wijst op nauwe genetische conservering in dit organisme gedurende de laatste 660 jaar. Zevenentwintig van deze posities werden niet gerapporteerd in een eerdere analyse van bestaande Y., pestis diversiteit14 (aanvullende tabellen 3 en 4). Vergelijking van ons oude genoom met zijn voorouder Y. pseudotuberculosis toonde aan dat de middeleeuwse sequentie de voorouderlijke nucleotide voor alle 97 posities bevatte, wat aangeeft dat het geen afgeleide posities bezit die afwezig zijn in andere Y. pestis stammen. Twee eerder gemelde chromosomale verschilen3 waren niet aanwezig in onze genomic opeenvolgingsgegevens, die suggereren dat zij waarschijnlijk uit gedeamineerde cytosines werden afgeleid die in het huidige onderzoek via uracil-DNA-glycosylasebehandeling vóór array-vangst zouden zijn verwijderd.,
om ons oude genoom in een fylogenetische context te plaatsen, hebben we alle 1.694 eerder geà dentificeerde fylogenetisch informatieve positionen14 (aanvullende tabel 4) gekarakteriseerd en die van ons oude organisme vergeleken met geaggregeerde basisaanroepgegevens voor 17 publiekelijk beschikbare Y. pestis genomen en de voorouderlijke Y. pseudotuberculose. Als we de sequenties van drie van de vier slachtoffers afzonderlijk bekijken, vallen er slechts twee substituties uit de wortel van alle aanwezige menselijke pathogene Y. pestis stammen (Fig. 3a), en ze tonen een nauwere relatie met tak 1 Y., pestis dan naar tak 2; echter, een van de vier slachtoffers (individuele 6330) werd geïnfecteerd met een stam die drie extra afgeleide posities die in alle andere tak 1 genomen14. Dit suggereert ofwel de aanwezigheid van meerdere stammen in de London 1348-1350 pandemie of micro-evolutionaire veranderingen in één stam, waarvan bekend is dat ze voorkomen bij uitbraken van ziekte15. Extra ondersteuning voor Y., pestis micro-evolutie wordt aangegeven door de aanwezigheid van verschillende verschillende posities waarvoor sequentiegegevens van één individu twee verschillende nucleotiden bij vergelijkbare frequenties laten zien (aanvullende tabel 5). Positie 2896636, bijvoorbeeld, is een bekende polymorfe positie in bestaande Y. pestis populaties14, en deze positie toont de vaste afgeleide toestand in een individu (6330) en de polymorfe toestand in een andere (individu 8291) bij minimaal vijfvoudige dekking (aanvullende Fig. 7). Dit is een opmerkelijk voorbeeld van micro-evolutie tijdens een historische pandemie., De resterende variantieposities zijn onveranderd in de 18 bestaande Yersinia genomen, dus ze kunnen uniek zijn voor het oude organisme en zijn daarom van verder belang. Extra bemonstering van Ancient genomen zal helpen bij het bepalen van de frequentie van deze mutaties in co-circulerende Y. pestis stammen, en zal de opkomst van tak 2 stammen die nog niet gerapporteerd in ancient stalen verduidelijken.
a, Mediaannetwerk van oude en moderne Y. pestis gebaseerd op 1.694 variantposities in moderne genomen14. Gekleurde cirkels vertegenwoordigen verschillende klassen zoals gedefinieerd in ref. 13. Grijze cirkels vertegenwoordigen hypothetische knopen. b, Phylogenetic tree met behulp van 1.694 variabele posities. Divergentie tijdsintervallen worden weergegeven in kalenderjaren, met neighbour-joining bootstrap ondersteuning (blauw cursief) en Bayesian posterior probability (blauw). Grijze doos geeft bekende menselijke pathogene stammen aan., A, NZ ACNQ01000; Nepal516, NC 008149; KIM10, NC 004088; B, NZ AAYT01000; C, NZ ABAT01000; D, NZ ACNS01000; E, NZ AAYS01000; F, NZ AAOS02000; CO92, NC 003143; G, NZ ABCD01000; H, NZ AAYV01000; I, NC 014029; J, NZ AAYR01000; Antiqua, NC 008150. c, Geographical origin of genome sequences used in a and b. d, Geographical spread of the Black Death from infection routes reported in ref. 4.,
PowerPoint slide
consistente boomtopologieën werden geproduceerd met behulp van verschillende constructiemethoden en alle belangrijke knooppunten werden ondersteund door posterior probability (pp) waarden van >0.96 en bootstrap waarden>90 (fig. 3b en aanvullende Fig. 8 en 9). De bomen plaatsen de East Smithfield sequentie dicht bij de voorouderlijke knoop van alle bestaande menselijke pathogene Y. pestis stammen (slechts twee verschillen in 1.694 posities) en aan de basis van tak 1 (Fig. 3b)., Een veilige datum voor de East Smithfield site van 1348-1350 liet ons toe om een tip kalibratie toe te wijzen aan de oude sequentie en zo de divergentietijd van de moderne genomen en het East Smithfield genoom te dateren met behulp van een Bayesiaanse benadering. Tijdschattingen geven aan dat alle Y., pestis vaak geassocieerd met menselijke infectie gedeeld een gemeenschappelijke voorouder ergens tussen 668 en 729 jaar geleden (ad 1282-1343, 95% hoogste kansdichtheid, HPD), omvat een veel kleiner tijdsinterval dan onlangs gepubliceerde schattingen 14 en verder aangeeft dat alle momenteel circulerende tak 1 en tak 2 isolaten ontstonden tijdens de dertiende eeuw op zijn vroegst (Fig. 3b), mogelijk afkomstig uit een Oost-Aziatische bron, zoals eerder werd voorgesteld14., Dit impliceert dat de middeleeuwse pest de belangrijkste historische gebeurtenis was die menselijke populaties introduceerde bij de voorouder van alle bekende pathogene stammen van Y. pestis. Dit vraagt verder de etiologie van de zesde tot achtste eeuw pest van Justinian, in de volksmond verondersteld te zijn voortgekomen uit dezelfde ziekteverwekker: onze temporele schattingen impliceren dat de pandemie ofwel werd veroorzaakt door een Y. pestis variant die verschilt van alle momenteel circulerende stammen gewoonlijk geassocieerd met menselijke infecties, of het was een andere ziekte in zijn geheel.
hoewel onze benadering van het gebruik van een bestaande Y., pestis referentie template voor aas ontwerp uitgesloten ons vermogen om genomische gebieden die aanwezig kunnen zijn geweest in het oude organisme te identificeren en werden vervolgens verloren in CO92, genomische vergelijkingen van onze oude sequentie tegen de dichtstbijzijnde outgroups kan waardevolle inzichten in Y. pestis evolutie opleveren. De Microtus 91001 stam is de dichtstbijzijnde tak 1 en tak 2 relatieve bevestigd niet pathogeen te zijn voor mensen16, vandaar genetische veranderingen kunnen bijdragen aan de aanpassing van de ziekteverwekker aan een menselijke gastheer., Vergelijkingen met deze uitgroep onthulden 113 veranderingen (aanvullende tabel 6a, b), waarvan vele worden gevonden in genen die virulentie-geassocieerde functies zoals biofilmvorming (hmst), ijzer-acquisitie (iucD) of aanpassing aan de intracellulaire omgeving (phoP) beïnvloeden. Op dezelfde manier, hoewel zijn virulentie potentieel in mensen nog moet worden bevestigd voor onze kennis, Y. pestis b42003004 geïsoleerd uit een Chinese marmot populatie 17 is geïdentificeerd als de stam het dichtst bij de voorouderlijke knoop van alle Y., pestis vaak geassocieerd met de menselijke pest, en dus kan belangrijke informatie met betrekking tot de evolutie van het organisme. De volledige genoomvergelijking tegen de opeenvolging van het Oosten Smithfield onthulde slechts acht enig-nucleotideverschillen (aanvullende tabel 6c), waarvan zes in niet-synonieme veranderingen resulteren (aanvullende tabel 6d). Hoewel deze verschillen waarschijnlijk geen invloed hebben op de virulentie, is de invloed van genverlies, genaanwinst of genetische herschikkingen, die allemaal goed gedocumenteerd zijn in Y. pestis12,18, nog onbekend., In meer recente evolutionaire termen, werden de enig-nucleotideverschillen in verscheidene bekende pathogeniteits-geassocieerde genen gevonden tussen ons oude genoom en de co92-referentievolgorde (aanvullende tabel 3), die verdere aanpassingen aan menselijke gastheren kan vertegenwoordigen.,door verrijking door DNA-vangst in combinatie met gerichte DNA-sequencing met hoge doorvoer, hebben we een ontwerp-genoom gereconstrueerd voor wat misschien wel de meest verwoestende menselijke pathogeen in de geschiedenis is, en hebben we onthuld dat de middeleeuwse pest van de veertiende eeuw waarschijnlijk verantwoordelijk was voor de introductie en wijdverspreide verspreiding in menselijke populaties. Dit wijst erop dat de ziekteverwekker die betrokken is bij de Zwarte Dood, in de eenentwintigste eeuw naaste verwanten heeft die zowel endemisch als opkomende zijn19., Introducties van nieuwe ziekteverwekkers bij populaties worden vaak geassocieerd met een verhoogde incidentie en ernst van ziektes20 en hoewel de mechanismen die dit fenomeen beheersen complex zijn21, zullen genetische gegevens van oude infectieziekten van onschatbare waarde bijdragen aan ons begrip van de coevolutie van gastheerpathogenen. De Zwarte Dood is een baanbrekend voorbeeld van een opkomende infectie die door Europa reist en in slechts vijf jaar tijd het leven eist van naar schatting 30 miljoen mensen, wat veel sneller is dan het huidige aantal builen-of pneumonische pestinfecties 22 en verspreiding7, 8., Hoe dan ook, hoewel geen bestaande Y. pestis stam hetzelfde genetische profiel heeft als ons oude organisme, suggereren onze gegevens dat er weinig veranderingen zijn opgetreden in bekende virulentie-geassocieerde genen in de 660 jaar van evolutie van het organisme als een menselijke pathogeen, wat verder suggereert dat de waargenomen verhoogde virulentie in de historie23 niet te wijten is aan nieuwe vaste puntmutaties die aantoonbaar zijn via de analytische benadering die hier wordt beschreven., Op onze huidige resolutie stellen we dat moleculaire veranderingen in pathogenen slechts een onderdeel zijn van een constellatie van factoren die bijdragen aan de veranderende prevalentie en ernst van infectieziekten, waar genetica van de gastheerpopulatie24, klimaat25, vectordynamiek26, sociale condities27 en synergetische interacties met gelijktijdige ziekten28 voorop zouden moeten staan in discussies over populatiegevoeligheid voor infectieziekten en gastheerpathogenrelaties met betrekking tot Y. pestis infecties.